Биологический метод исследования при туберкулезе

Классификация
При туберкулёзе поражаются различные органы. Но в 90% случаев процесс локализуется в легких.
VII Всесоюзный съезд фтизиатров (1964) принял клиническую классификацию туберкулёза.

А. Основные клинические формы туберкулеза
Группа I — туберкулез органов дыхания (см. Туберкулез легких).

Группа II — туберкулезная интоксикация у детей и подростков.

Группа III — туберкулез других органов. Туберкулез костей и суставов. Туберкулез периферических лимфатических узлов. Туберкулез кожи и подкожной клетчатки. Туберкулез мозговых оболочек центральной нервной системы. Туберкулез глаз. Туберкулез кишечника, брюшины и лимфатических узлов брюшной полости. Туберкулез мочевых и половых органов. Туберкулез прочих органов.

Б. Характеристика туберкулезного процесса
Формы: а) открытые формы (БК+); б) закрытые формы (БК—).

Фазы развития процесса: а) инфильтрация, распад, обсеменение; б) уплотнение, рубцевание, обызвествление, рассасывание.

Бацилловыделение: БК+, БК—, БК± (периодическое бацилловыделение).

Лабораторные исследования при туберкулезе
Основной задачей лабораторных исследований является бактериологическая диагностика туберкулёза: прямая — путем микроскопического исследования патологического материала; непрямая — различными биологическими методами. Исследуются мокрота, слизь из гортани, промывные воды желудка и бронхов, отделяемое из свища и др.

При скудном выделении мокроты исследуют на микобактерии туберкулёза промывные воды желудка. Для этого больному утром натощак дают выпить 200 мл дистиллированной воды и тут же толстым зондом жидкость извлекают из желудка в стерильный стакан, добавляют 2—3 мл 0,5% раствора едкого натра; смесь встряхивают в течение 5 мин., затем добавляют 1—2 мл ксилола или бензина и вновь встряхивают в течение 5—10 мин. Через 30 мин. образовавшееся в колбе сливкообразное кольцо обрабатывают по той же методике, как и мокроту.

Техника исследования промывных вод бронха по Я. С. Зобину следующая: утром натощак орошают через пульверизатор 1% раствором дикаина (2 мл) язык, слизистую оболочку дужек, глотки и грушевидных ямок; через 2—3 мин. в гортань вливают шприцем 1—2 мл 2% раствора дикаина. Через 2—3 мин. лежащему на исследуемом боку больному медленно вливают гортанным шприцем на середину основания языка изотонический раствор хлорида натрия в количестве 10— 20 мл; во избежание проглатывания его необходимо держать высунутый язык больного марлевой салфеткой. В результате раздражения изотоническим раствором слизистой оболочки бронхов наступает повышенное отделение слизи и усиление кашля. Больной откашливает раствор вместе со слизью из глубоких дыхательных путей в стерильный стаканчик. Противопоказания: заболевания сердца и сосудов, бронхиальная астма.

Бактериологический метод исследования на туберкулёз показательней бактериоскопического, хотя в некоторых случаях под влиянием химиотерапии микобактерии туберкулёза могут не дать роста на питательных средах, в то время как при бактериоскопии они выявляются.

Для посева мокроту собирают в стерильную баночку или плевательницу после того, как больной прополощет рот и глотку кипяченой водой. После взятия мазка из мокроты ее переливают в толстостенную баночку с бусами или битым стеклом и гомогенизируют энергичным встряхиванием. Затем заливают мокроту равным количеством 3—5% раствора серной кислоты, тщательно смешивают и центрифугируют; обработка мокроты серной кислотой должна продолжаться в течение 20 мин., из них 10 мин. занимает центрифугирование. После этого надосадочную жидкость сливают в дезинфицирующий раствор, а осадок засевают в 3—4 пробирки с яичной средой.

Посев спинномозговой жидкости, мочи, экссудата, промывных вод желудка и бронхов. Вначале материал центрифугируют и осадок засевают на яичные среды, причем если материал не содержит вторичной флоры (спинномозговая жидкость, серозный экссудат), то предварительной обработки не требуется.

Биологический метод диагностики туберкулеза. При отрицательных результатах бактериоскопии и посева прибегают в случае необходимости к опытам на животных. Этот метод дает возможность определить в исследуемом материале жизнеспособные и вирулентные микобактерии туберкулёза. Обработка материала проводится так же, как и для посева, но здесь требуется более тщательное отмывание осадка от следов серной кислоты изотоническим раствором (дважды) с последующим центрифугированием. Затем полученную эмульсию вводят в количестве 0,5—2 мл морской свинке в область паха. Если животное не погибнет, то через 3—5 месяцев его забивают и секционный материал подвергают патологоанатомическому исследованию на туберкулёз.

Цитодиагностика туберкулеза. Методом аспирационной биопсии (см.) можно извлекать материал из лимфатического узла, костного мозга, легких и других паренхиматозных органов, приготавливать мазки и после предварительной окраски изучать под микроскопом.

Рис. 5. Пунктат шейного лимфатического узла при туберкулезе; туберкулезный бугорок из эпителиоидных клеток, окруженных лимфоцитами.
Рис. 6. Пунктат печени при туберкулезе; казеозный детрит, в котором видны единичные лимфоциты и распадающиеся нейтрофилы; вверху — группы эпителиоидных клеток; внизу — две печеночные клетки, содержащие биливердин.

источник

Основными методами выявления возбудителя туберкулеза остаются бактериоскопический, культуральный и биологический. Чувствительность каждого из этих методов известна. Если для обнаружения бактериоскопическим способом единичных микобактерий туберкулеза в препарате необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 000—500 000 особей, то для выделения культуры микобактерий достаточно 20—100 микробных клеток. Имеются данные, что при заражении животных (особенно чувствительных морских свинок) туберкулезные изменения в их органах могут быть обнаружены при содержании в 1 мл материала единичных (1—5) микобактерий.

Особенности бактериовыделения в условиях интенсификации антибактериальной терапии вызвали необходимость, с одной стороны, применять в повседневной практике способы обогащения или накопления микобактерий в единице исследуемого объекта патологического материала, с другой — усовершенствовать методы исследования.

Применение способов обогащения, а именно метода флотации и седиментации, значительно увеличило выявление возбудителя туберкулеза. Появление флюоресцентной микроскопии, введение щадящих методов обработки материала, одновременного посева патологического материала на питательные среды с разным составом также позволили увеличить результативность микробиологической диагностики туберкулеза.

Исследования, касающиеся разных апскетов бактериовыделения, показали, что у впервые выявленных больных с деструктивными изменениями в легких микобактерии туберкулеза могут определяться в 100% случаев, а у вновь выявленных больных без деструкции — в 20—40%.

Все методы обнаружения, а также идентификации микобактерий основаны на особенностях этой группы микроорганизмов. Свойства кислото-, спирто- и щелочеустойчивости используются для дифференциальных окрасок микобактерий при бактериоскопии, специфичной обработки патологического материала для посева и заражения лабораторных животных.

Чаще объектом исследования являются мокрота больных с различной легочной патологией или промывные воды бронхов. Объектами исследования могут быть как пунктаты из закрытых полостей (цереброспинальная жидкость, экссудаты и транссудаты из плевральной и брюшной полостей, гной из натечни-ков, ткань, полученная при биопсии или во время операции), которые должны быть взяты с соблюдением правил асептики, как и отделяемое открытых полостей (гной из свищей, отделяемое из ран, менструальная кровь и т. д.). Особого внимания требует сбор мочи. Для исследования используют утреннюю порцию, полученную после тщательного туалета наружных половых органов. При отрицательных результатах это исследование повторяют 2—3 раза подряд, используя суточную порцию мочи.

Бактериоскопический метод исследования остается одним из основных методов. Преимущество его заключается в быстроте получения результатов. Однако возможности его ограничены. Известно, что положительный результат при прямой бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю — Нильсену, может быть получен при значительном содержании микобактерий туберкулеза в патологическом материале. Больные, особенно в процессе антибактериальной терапии, могут выделять микобактерии в небольшом количестве. В таких случаях метод может оказаться недостаточно чувствительным для их выявления, что обусловливает применение вышеуказанных методов обогащения или накопления. Наибольшее распространение получил метод флотации, при котором микобактерии туберкулеза, содержащиеся в патологическом материале, при встряхивании водной суспензии этого материала с углеводородом, имеющим меньшую относительную плотность, чем вода, всплывают вместе с образующейся пеной. В качестве углеводорода применяют бензин, бензол, ксилол или толуол.

Для исследования 10—15 мл мокроты переливают в бутылку вместимостью 250 мл и добавляют равное количество 0,5% раствора едкого натра или едкого кали с целью гомогенизации. Через 5—10 мин тщательного встряхивания к гомогенизированной мокроте добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл любого углеводорода. После повторного встряхивания в течение 5—10 мин бутылку доливают до горлышка дистиллированной водой. Через 30 мин после добавления воды на поверхности образуется сливкообразное кольцо, состоящее из капелек углеводорода и микобактерий туберкулеза. Препараты для бактериоскопии готовят из флотационного кольца. На предметные стекла пастеровской пипеткой наносят несколько капель содержимого флотационного кольца, занимая 1/3 площади. После подсыхания мазка вновь той же пипеткой наносят капли флотационного кольца. Такое наслаивание производят 3—4 раза, предварительно высушивая предыдущую каплю. Затем высушенные мазки фиксируют в пламени горелки и окрашивают.

Метод флотации повышает обнаружение микобактерий туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией более чем на 10%. Метод седиментации в настоящее время является одним из обязательных лабораторных исследований в диагностике туберкулеза, включающих бактериоскопии^ и одновременно посев патологического материала на питательные среды.

Обработка патологического материала фосфатом натрия для посева на питательные среды является одновременно и методом накопления. Фосфат натрия — прекрасный гомогенизатор мокроты и щадящий реактив для микобактерий туберкулеза. Обработка им допускает длительную экспозицию с патологическим материалом без значительного нарушения жизнеспособности микобактерий туберкулеза. Одновременно он угнетает рост сопутствующей неспецифической флоры даже при длительном хранении материала.

К исследуемому материалу добавляют равное по объему количество 10% раствора фосфата натрия и инкубируют эту смесь при 37°С в термостате в течение 24 ч. Затем материал центри-фугирируют 5—10 мин при 2000 об/мин, сливают надосадочную жидкость, осадок засевают на питательные среды, а также делают мазок для микроскопирования.

Основным методом окраски мазков из патологического материала для выявления кислотоустойчивых микобактерий является метод Циля — Нильсена, основанный на добавлении к краске (фуксин) протравы (карболовая кислота) и подогревании в процессе окраски, дальнейшем обесцвечивании в серной кислоте или солянокислом спирте и последующем докрашивании метиленовым синим.

Распространен также метод окраски мазка по Шпенглеру. В этом случае для докрашивания применяют пикриновую кислоту, которая позволяет выявлять микобактерии в более глубоких слоях мазка. Фиксированный препарат окрашивают и обесцвечивают, как при применении метода Циля — Нильсена, и после промывания водой на 1—2 мин погружают в насыщенный раствор пикриновой кислоты.

В настоящее время в связи с интенсивной и длительной антибактериальной терапией больные могут выделять микобактерии с измененными морфологическими и тинкториальными свойствами. Это вызывает определенные затруднения как при выявлении возбудителя, так и при дифференциации его от нетуберкулезных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

В таких случаях требуются дополнительные доказательства отличия обнаруженных микобактерий от их непатогенных вариантов. Частично это удается путем более длительного, чем обычно, обесцвечивания мазков кислотой, спиртом (40—60 мин) или жавелевой водой (45—60 мин). Большинство кислотоустойчивых сапрофитов после такой обработки частично или полностью теряют первоначальную окраску. Однако для точной дифференциации микобактерий туберкулеза необходимо использовать комплекс бактериологических и биохимических методов, а в случае необходимости — биопробу.

В последнее время приобретает актуальность определение живых и мертвых микобактерий в мазках из патологического материала, что важно для оценки эффективности химиотера-певтических мероприятий. Принцип определения жизнеспособности микобактерий туберкулеза основан на различной окраске дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микробной клетки у живых и мертвых микобактерий. При этом нативная ДНК (у живых клеток) может воспринимать некоторые основные красители (например, метиленовый зеленый), деполимеризованная ДНК (у мертвых клеток) теряет способность окрашиваться этими красками, но воспринимает окраску дополнительными красителями пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Окрашенные мазки микроскопируют под иммерсией в обычном световом микроскопе. Количественные методы определения бактериовыделения приобретают большое значение для оценки тяжести процесса, выбора тактики лечения и его прогноза. В начальный период антибактериального лечения снижение массивности бактериовыделения является одним из основных показателей эффективности химиотерапии. В связи с этим в лабораторной практике применяются более точные методы количественной оценки бактериовыделения. Наиболее распространен бактериоскопический метод Гаффки — Стинкена, модифицированный Т. Н. Чайкиной, количественной оценки бактериовыделения у больных туберкулезом легких, а также количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

Наиболее результативным бактериоскопическим методом выявления микобактерий туберкулеза является люминесцентная микроскопия, которая позволяет дополнительно выявить микобактерии туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией в 14—30% случаев. Метод основан на способности микобактерий туберкулеза воспринимать окраску специальными красителями — флюорохромами, которые при облучении короткими синими или ультрафиолетовыми лучами начинают светиться. Интенсивность свечения зависит от степени абсорбции красителя, а цвет — от характера флюорохрома и физико-химического состояния бактериальной клетки.

Для окраски мазков применяют смесь аурамина 00 и родамина С (метод Хагемана в модификации Ю. Н. Зубжицкого, метод Боя в модификации И. К. Целлариуса, К. В. Шмалий) или акридиновый оранжевый (метод Адамчика). Микроскопическая картина мазка весьма контрастна, светящиеся микобактерии хорошо видны при малом увеличении объектива. Преимущества метода состоят в высокой его чувствительности, простом способе окраски и экономии времени при микроскопии.

Бактериологические (культуральные) методы выявления микобактерий туберкулеза по сравнению с бактериоскопическими отличаются большей чувствительностью. Положительные результаты можно получить при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных микроорганизмов. Это особенно важно при исследовании олнго-,бациллярного материала от впервые выявленных или мало леченных больных туберкулезом.

Основным преимуществом бактериологического метода выделения микобактерий является возможность получения чистой культуры микобактерий, которые могут быть подробно исследованы и идентифицированы; у них могут быть определены лекарственная чувствительность, вирулентность, биохимические и биологические особенности (ферментативная активность, вид микобактерий, степень жизнеспособности и др.). Однако известны трудности применения этого метода, связанные со сложностью обработки патологического материала, медленным размножением микробных клеток и соответственно появлением видимых колоний микроорганизмов. Все это снижает ценность метода для оперативного использования его результатов в клинике туберкулеза.

Для обработки патологического материала перед посевом на питательные среды используют различные вещества, которые должны обеспечить гомогенизацию материала, максимально сохранить жизнеспособность микобактерий туберкулеза, полностью подавить рост неспецифической микрофлоры, которая может находиться в исследуемом материале, быть простыми и экономичными.

Предварительную обработку патологического материала производят кислотами, щелочами, ферментами, детергентами (поверхностно-активные вещества).

В настоящее время применяют:

• 1) метод Гона — обработка растворами серной кислоты (от 2 до 6%) в зависимости от характера материала (для мочи —10%) с последующим центрифугированием и отмыванием;
• 2) метод Петрова — обработка 4% едким натром с последующим центрифугированием и нейтрализацией осадка перед посевом;
• 3) обработка 10% фосфатом натрия — наиболее широко используемый, удобный и экономичный метод.

Следует подчеркнуть перспективность применения поверхностно-активных веществ, таких как лаурилсуль-фат, лауросепт, хлоргексидинглюконикум, диоцид и др. Преимущества детергентов более четко проявляются при обработке бактериоскопически отрицательных проб мокроты. Рост микобактерий туберкулеза отмечается в 36% случаев после применения лауросепта, в 28% случаев — после применения 4% раствора едкого натра или в 20% — после применения 10% раствора натрия.

В последнее время предложен метод посева необработанного патологического материала на селективные среды (в том числе на среду 7Н10), содержащие различные антибактериальные препараты (полимиксин, амфотерицин, карбенициллин, триметоприм), задерживающие рост неспецифической микрофлоры. При этом частота загрязнения посевов уменьшается в 2—3 раза по сравнению с посевом обработанного патологического материала по стандартному методу Петрова, а также отмечается более интенсивный рост культур микобактерий туберкулеза.

Для культивирования микобактерий туберкулеза существует большое количество различных питательных сред — твердых, полужидких и жидких, последние в свою очередь можно разделить на синтетические и полусинтетические. Однако ни одна из питательных сред не обладает всеми качествами, предъявляемыми к ней современной бактериологической диагностикой. В связи с этим для увеличения результативности культурально-го метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2—3) различных питательных сред. Для выделения чистых культур чаще применяют твердые яичные среды и полужидкие яичные и агаровые среды. В качестве стандартной среды для первичного выращивания и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Всемирной организацией здравоохранения рекомендована твердая яичная среда Левенштейна — Йенсена. На этой среде хороший рост микобактерий получают на 15— 25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

Заслуживают внимания среда «Новая», предложенная Г. Г. Мордовским; среда 2, предложенная Э. Р. Финном; среды 6 и 9, предложенные В. А. Аникиным и соавт. Среда «Новая» содержит желтки куриных яиц, стимулирующие рост микобактерий, а также гликокол, наиболее полно потребляемую из среды аминокислоту [Лазовская А. Л., 1962]. Среда 2 (Финна) отличается по составу от среды Левенштейна — Йенсена отсутствием L-аспарагина, вместо которого используют глутаминат натрия. На этой среде рост микобактерий появляется на несколько дней раньше, однако процент выделения культур и» патологического материала такой же или, по данным некоторых авторов, выше.

Среды 6 и 9 (Аникина) отличаются от описанных выше питательных сред по химическому составу и физическим свойствам. Источником азотистого питания микобактерий в этих средах являются белковые ферментолизаты — препараты микробиологического синтеза, а также аммонийные соли винной и янтарной кислот. Среды обладают высокой информативностью.

Перспективны для дальнейшей разработки и усовершенствования полужидкие среды, создающие более благоприятные условия для роста микобактерий и позволяющие быстрее (череа 7—10 дней) получать положительные результаты. Среди них следует отметить среду Калфина на яичной основе и агаровые среды Миддлбрука 7Н11, 7Н12. В прозрачной среде Миддл-брука рост микроколоний учитывается визуально, в то время как при посеве на среду Калфина увеличивается затрата труда на производство мазков и микроскопирование.

Добавление к агаровой среде ТИП 5 мкг/мл селената натрия позволяет получить видимый рост колоний микобактерий туберкулеза на 3—5-й день по сравнению с 12 днями при посеве суспензии культур на среды, не содержащие селената натрия. Меньшее значение для обнаружения в патологическом материале микобактерий туберкулеза имеет посев на жидкую питательную среду (полусинтетическая среда Школьниковой, синтетическая среда Сотона, кровяная среда и т. д.). Рост микобактерий на этих средах виден невооруженным глазом на дне пробирки на 10—15-й день, а в мазке — в виде кос или скопления кучек. Недостатком этих сред является невозможность получения чистой культуры для дальнейшего исследования и большая частота приростов неспецифической флоры. Помимо глубинного посева на жидкие среды, их используют для метода микрокультивирования на стеклах по Прайсу. Этот метод также дает возможность в короткий срок (10—15 дней) получить рост микобактерий в виде микроколоний, которые после окраски по Цилю — Нильсену хорошо видны под микроскопом. Однако описанная методика довольно трудоемкая и небезопасная, поэтому не рекомендуется для использования. В настоящее время разрабатываются и применяются радиометрические методы быстрого выявления роста микобактерий при посеве патологического материала на специальные селективные среды: селективный агар Mitchison 7Н10 и селективный бульон Миддлбрука 7Н12. Последний включает в себя меченную 14С пальмитиновую кислоту. Регистрацию роста культур производят радиометрически при помощи системы ВАСТЕС. Среднее время определения роста микобактерий туберкулеза из бактериоскопически положительного материала составляет 8,3 дня, из бактериоскопически отрицательного — 13,7 дня по сравнению с 19,4 и 26,3 дня соответственно при обычных методах посева на плотные и полужидкие среды.

Таким образом, для бактериологического исследования может быть использован различный патологический материал. Способы обработки его могут быть различными в зависимости от характера материала, метода посева и применяемой питательной среды. Возможен посев патологического материала и без предварительной обработки, если он не содержит посторонней микробной флоры (цереброспинальная жидкость, серозные экссудаты и т. п.). После инкубации посева в термостате при 37 °С учитывается интенсивность роста микобактерий на твердых средах по четырехбалльной системе: +- единичные колонии (меньше 20), ++- от 20 до 50 колоний, +++- от 50 до 100 колоний, ++++- несосчитываемое количество колоний. В основном положительные результаты посевов определяются до 2 мес инкубации.

Биологический метод исследования до последнего времени считался наиболее чувствительным и эффективным способом обнаружения микобактерий туберкулеза. В настоящее время к этому методу исследования относятся более сдержанно. В связи с введением в клиническую практику интенсивной антибактериальной терапии и появлением значительного количества измененных форм возбудителя, устойчивых к лекарственным препаратам, особенно к препаратам изоникотиновой кислоты, заражение животных может дать отрицательный результат при получении роста культуры на питательных средах. Это объясняется снижением или полной потерей вирулентности лекарственноустойчивых вариантов. При исследовании олигоба-циллярного материала одновременно методом посева и биологической пробой установлен примерно одинаковый процент (6,8—7,2%) выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала. Тем не менее заражение морских свинок в ряде случаев (особенно при отрицательной бактериоскопии и посеве) остается необходимым методом диагностики туберкулеза. При этом целесообразно сочетание одновременного заражения животных и посева патологического материала.

Для увеличения чувствительности биологического исследования многие авторы рекомендуют искусственно снижать резистентность морских свинок ежедневным введением больших доз (12,5 ЕД) кортизона. Использование кортизона со дня заражения животных позволило дополнительно установить присутствие микобактерий туберкулеза в патологическом материале в 15—29% случаев. Положительного результата биопробы можно добиться, применяя последовательные пассажи. Заражая животных органами убитых, ранее зараженных животных, у которых не были обнаружены туберкулезные изменения, иногда на 3—5 пассажах удается получить видимые специфические поражения у морских свинок.

Для этой же цели применяют интратестикулярное заражение морских свинок патологическим материалом. При таком методе заражения удается обнаружить в патологическом материале маловирулентные изониазидоустойчивые микобактерии.

Биологическое исследование используют в диагностических целях для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания у нелеченых больных, для установления бактериовыделения у больных, принимавших препараты непродолжительное время. Особую ценность представляет биологическая проба при исследовании материалов от больных, страдающих урогени-тальным туберкулезом, а также для изучения свойств выделенных культур, определения их вирулентности, принадлежности к тому или иному виду.

Выделение трансформированных форм микобактерий. Широко применяемые рутинные методы не позволяют выявить указанные измененные формы возбудителя и, следовательно, в части случаев дают неадекватную информацию о состоянии процесса.

В настоящее время разработан диагностический комплекс целенаправленного выделения L-форм микобактерий. Исследованию на L-формы микобактерий может быть подвергнут любой патологический материал, который гомогенизируют (механически), затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты, центрифугируют и повторно отмывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Посев осадка производят в 3—5 пробирок с полужидкой (0,3% агар-агара) питательной средой, приготовленной на основе полусинтетической среды Школьниковой с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 20% сахарозы в качестве осмотического протектора и по 5 ЕД/мл антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) для подавления роста неспецифической микрофлоры.

Каждый посев сопровождается обязательным контрольным засевом материала в 2 пробирки с указанной выше средой, одна из которых (контроль 1) не содержит антибиотиков, другая (контроль 2) — сахарозы. Кроме того, материал засевают в 2— 3 пробирки с плотной яичной средой для исключения в исследуемом образце бактериальных форм возбудителя. Учет результатов посева и их интерпретацию производят через 1—2 мес по данным фазово-контрастной микроскопии препаратов согласно схеме выделения и учета L-форм бактерий. Применение этого комплекса показало, что при исследовании патологического материала больных различными формами туберкулеза в процессе химиотерапии L-формы микобактерий туберкулеза можно выделить в 20—100% случаев.

Дифференциация выделенных культур является одним из важнейших звеньев лабораторной диагностики туберкулеза. Она представляет большие трудности вследствие выделения у больных измененных и трансформированных микобактерий туберкулеза, микобактерий бычьего и птичьего видов, атипичных или нетуберкулезных микобактерий, в том числе и кислотоустойчивых сапрофитов. Многие из них по виду не отличаются от микобактерий туберкулеза. Для правильной оценки их патогенетической роли в заболевании человека необходима точная идентификация выделенных культур. Разработан и введен в лабораторную практику основной набор микробиологических и биохимических методов идентификации микобактерий, включающий два комплекса исследований. В первый комплекс исследований входят наиболее простые и легко воспроизводимые методики, на основании которых решается вопрос о принадлежности выделенной культуры к микобактериям туберкулеза или атипичным. При этом учитываются: скорость роста на яичных, агаровых и жидких средах; образование пигмента (в темноте и на свету); возможность роста на простых средах (мясопептонный бульон, агар, перевар Хоттингера); активность каталазы; активность перокси-дазы; термостабильность каталазы. Во второй комплекс исследований входят более сложные методы, на основании которых можно установить вид микобактерий, степень вирулентности, я также группу по Раньону, если выделены атипичные культуры. Этот комплекс включает в себя: определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам (изониазид, ПАСК и др.); определение роста на яичной среде с препаратами, ингибирующими рост микобактерий туберкулеза (салицилат натрия, паранитробензойная кислота, тибон, 5% NaCl); способность продуцировать корд-фактор при глубинном росте на жидких питательных средах; образование ни-ацина (упрощенный вариант ниацинового теста, метод Кубика и Кельбурна в модификации Бараускене); определение амидаз-ной активности (метод Бенике, метод Такэ); гидролиз твина-80 и др.

В литературе встречается описание более 100 различных тестов для дифференциации микобактерий, что указывает на несовершенство каждого из методов для целей идентификации и необходимость применения комплекса исследований.

В настоящее время бактериологические методы исследования приобретают существенное значение для определения тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания.

Определены три направления этих исследований.

1. Использование количественных методов определения бактериовыделения у соответствующих групп больных туберкулезом в процессе химиотерапии. Установление снижения или повышения количества выделяемых микобактерий туберкулеза может служить объективным показателем эффективности проводимого лечения. Для этой цели применяется модифицированный метод Гаффки-Стинкена и количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

2. Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Изменение чувствительности микобактерий отмечается ко всем противотуберкулезным средствам, однако отличается по степени, частоте и скорости появления устойчивых вариантов. Деление микобактерий на чувствительные и устойчивые производится на основании критериев, установленных клинико-лабораторными исследованиями. Мерой чувствительности, или критерием чувствительности, является минимальная концентрация препарата, задерживающая рост микобактерий при стандатных условиях постановки опыта. Эти величины при определении чувствительности микобактерий на жидких и плотных средах несколько отличаются друг от друга. Устойчивыми считают микобактерии, растущие при приведенных ниже показателях (табл. 6).

Во фтизиатрической практике приняты условные понятия первичной и вторичной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Первичной устойчивостью микобактерий считают устойчивость, которая была определена у микобактерий, выделенных от больных, не принимавших противотуберкулезных препаратов. Вторичной устойчивостью считается устойчивость микобактерий, выделенных от больных в процессе лечения противотуберкулезными препаратами. Эти понятия введены для обоснования различного подхода к лечению больных.

По данным Mitchison (1972), Rist (1972), Petersen (1983), Toldisan и соавт. (1983), первичная лекарственная устойчивость к изониазиду в развитых странах составляет около 4— 5% (1,8—5,9%) среди вновь выявленных больных туберкулезом, более тяжелая ситуация наблюдается в развивающихся странах, где первичная устойчивость к этому препарату возросла до 44%. По данным Е. Е. Кузнецовой (1972), IT. М. Рудого (1969), первичная устойчивость микобактерий в России колеблется на различных территориях в пределах 6—10,1%. Вторичная устойчивость микобактерий ко всем препаратам установлена в 40—70% случаев.

Известно, что бактериальная популяция, выделенная из патологического материала, часто содержит смесь устойчивых и чувствительных микобактерий. Кроме того, она может содержать особи с неодинаковой степенью устойчивости к одному или к нескольким лекарственным средствам, а также микобактерии с двойной резистентностью или полирезистентностью.

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза, как правило, проводят раздельно к каждому противотуберкулезному препарату. Для определения двойной устойчивости микобактерий туберкулеза был предложен метод перекрестных посевов и посевов на смеси препаратов, к которым была определена двойная устойчивость.

В настоящее время лекарственную чувствительность микобактерий определяют бактериологическими методами разведений в плотной и в жидкой питательной среде. Имеется значительное количество модификаций этих методов.

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности в жидкой среде являются метод глубинного посева микобактерий и метод микрокультивирования на стеклах (метод Прайса). Методы весьма трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, их окраски и микроскопирова-ния, требуют соблюдения большей стерильности. Однако результаты определения получают в более короткие сроки (12— 14 дней). Применение этих методов оправдано для прямого определения чувствительности микобактерий непосредственно из патологического материала. При этом в патологическом материале должно содержаться не менее 1—5 микобактерий в каждом поле зрения. Совершенствование методов определения лекарственной чувствительности направлено на уменьшение времени получения ответа лабораторного исследования. Предложен метод прямого определения чувствительности микобактерий в жидких средах при постоянном их аэрировании при инкубации в термостате. Рост микобактерий через 7—8 дней определяют нефелометрически или при микроскопии осадка после центрифугирования. Наиболее быстрое (через 4—6 дней) получение результатов лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза возможно при использовании радиометрического метода, включающего посев выделенных от больных культур на жидкую среду 7Н12, содержащую меченную 14С пальмитиновую кислоту (система ВАСТЕС).

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности на плотной среде являются метод абсолютных концентраций (метод Майснер) и метод пропорций. Эти методы менее трудоемки, позволяют использовать патологический материал, содержащий любое число микобактерий, поскольку определение может проводиться у предварительно выделенных из патологического материала микобактерий. Это обстоятельство удлиняет сроки получения результатов. Однако определение чувствительности при этом производится путем засева дозированного числа микобактерий, что позволяет более точно определить степень их чувствительности.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории. В качестве унифицированного метода рекомендуется метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна — Йенсена. Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулезного препарата, ингибирующей рост культуры микобактерий при выращивании их на среде с различным содержанием препаратов. Метод достаточно точен и наиболее прост.

3. Определение в процессе химиотерапии бактериостатиче-ской активности крови больных после приема противотуберкулезных препаратов позволяет исследовать особенности фарма-кокинетики этих препаратов и их сочетаний в организме, выражающиеся в величине их бактериостатического действия. Известно, что величина бактериостатической концентрации препаратов является одним из важных факторов, определяющих эффективность антибактериальной терапии. В свою очередь уровень бактериостатически активного препарата в крови и очагах поражения зависит от физико-химических свойств лекарства, условий его всасывания, распределения, биотрансформации и скорости элиминации. Большое значение имеет доза препарата, метод введения, а также комбинация лекарства с другими туберкулостатическими средствами. Достаточный бак-териостатический уровень препарата в крови больных можно определять несколькими путями.

• 1. Применение туберкулостатической пробы позволяет определить достаточность концентрации изо-ниазида в крови больных для подавления роста микобактерий, предварительно выделенных от этих больных.
• 2. Определение концентрации антибактериальных препаратов в крови больных микробиологическим методом серийных разведений или химическим методом и сравнение этих показателей с лекарственной резистентностью выделенных микобактерий туберкулеза может подсказать клиницистам более правильную тактику дальнейшего лечения больного.
• 3. Определение бактериостатической активности крови больных после приема отдельных препаратов и их комбинаций методом серийных разведений с использованием стандартного тест-штамма «Академия», обладающего чувствительностью ко всем препаратам, лежащей в пределах чувствительности диких штаммов микобактерий, позволяет сравнить активность как отдельных препаратов, так и различных комбинаций и выбрать наиболее целесообразные сочетания. Эти исследования рационально проводить для выяснения причин неэффективности антибактериальной терапии и выбора пути и средств направленной ее коррекции.

источник

Методы определения лекарственной чувствительности микобакте­рий. В лабораторной практике используют три основных метода определения лекарственной чувствительности микобактерий: метод абсолютных концентра­ций; метод соотношения резистентности; метод пропорций.

Метод абсолютных (предельных) концентраций заключается в следую­щем. Микобактерий выращивают на питательных средах, содержащих проти­вотуберкулезные препараты (ПТП) в различных концентрациях. Определение лекарственной чувствительности МБТ может быть прямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами патологического материала) и непрямым (посев на среды с противотуберкулезными препаратами выделенных культур микобактерий). Прямой способ позволяет значительно ускорить процесс полу­чения результата, но им можно пользоваться только тогда, когда микобактерий обнаруживаются в исследуемом материале бактериоскопически и содержатся в нем в значительном количестве. Лекарственную чувствительность можно опре­делять на плотных и жидких питательных средах. В современной лабораторной практике ее обычно определяют на среде Левенштейна-Йенсена, не содержа­щей крахмала, которая принята ВОЗ в качестве международного стандарта. Унификация определения лекарственной чувствительности МБТ позволяет по­лучать сравнимые результаты при проведении эпидемиологических исследова­ний. При определении лекарственной чувствительности на плотных питатель­ных средах результат учитывают через 3 недели после посева по макроросту МБТ на поверхности среды, на жидких питательных средах — через 10-12дней по наличию микроколоний в виде переплетающихся жгутов и кос в мазках из осадка.

Определение лекарственной чувствительности на плотных и жидких пи­тательных средах имеет свои преимущества и недостатки. На плотных средах можно получить более четко сравнимые результаты. При массовых исследова­ниях этот метод менее трудоемок, однако он более продолжителен по времени получения результата. В плотных средах во время свертывания может несколь-

ко уменьшаться содержание некоторых термолабильных препаратов, например, стрептомицина. Определение лекарственной чувствительности на жидких сре­дах более трудоемко, требует микроскопии препаратов, но результат можетбыть получен в более короткие сроки. Недостатком этого способа является то, что больные, леченные антибактериальными препаратами, могут выделять ми­кобактерий, лишенные корд-фактора, не дающие при размножении жгутов или паукообразных микроколоний, наличие которых служит критерием устойчиво­сти к препарату.

Метод соотношения резистентности (resistance ratio method) заключа­ется в определении соотношения минимальных ингибирующих концентраций противотуберкулезных препаратов для тестируемого штамма и референс-штамма H37R.V, чувствительного ко всем препаратам. Величина соотношения 2 и менее характеризует штамм как чувствительный, 8 и более — как устойчивый.

Вариантом метода минимальных ингибирующих концентраций является E—test. Лекарственная устойчивость микобактерий с использованием этого ме­тода определяется на чашках с агаровой средой, на которые помещают полоски, содержащие градиент концентраций противотуберкулезных препаратов. Чувст­вительность микобактерий к препаратам оценивается по наличию зоны ингиби-рования роста микобактерий вокруг полоски. Использование E—test позволяет определять лекарственную чувствительность МБТ в течение 5-10 дней.

Метод пропорций был предложен Canetti в 1963 году. Он заключается в определении соотношения числа колоний, выросших на среде, содержащей противотуберкулезный препарат, и числа колоний в контрольной пробирке, не содержащей препарата. Это соотношение является отражением пропорции ре­зистентных бактерий в популяции. Метод позволяет количественно оценить степень резистентности штамма МБТ, однако широкое применение его в клас­сическом варианте затруднено вследствие большой трудоемкости. Определение лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций может проводиться с использованием автоматических систем ВАСТЕС, MGIT, Esp Culture System и др.

Целью интерпретации результатов определения лекарственной чувстви­тельности МБТ к ПТП являются прогнозирование клинической эффективности ПТП у конкретного больного и обоснование рекомендаций по проведению оп­тимальной химиотерапии.

В качестве критериев для отнесения штаммов МБТ к категории чувстви­тельных или устойчивых используют пороговые значения минимальных инги­бирующих концентраций (МИК) ПТП, избранные на основе комплекса микро­биологических, фармакокинетических и клинических показателей. Данные о величине МИК ПТП в отношении штаммов МБТ, выделенных от больных,служат микробиологическим критерием для определения величины пороговых концентраций. Кроме того, при определении пороговых МИК учитывают дан­ные по фармакокинетикс ПТП. Основным показателем при этом является мак­симальная концентрация ПТП, которая создается в сыворотке крови послеприема ПТП в среднетерапевтической дозе. Четкая зависимость между этим показателем и величинами пороговых МИК отсутствует. В самом общем виде

можно лишь сказать, что пороговые МИК не могут быть выше максимально достижимых в сыворотке крови. И, наконец, третьим критерием для определе­ния пороговых значений МИК служат данные о клинической эффективности ПТП при заболевании, вызываемом микроорганизмами с различными МИК. Таким образом, предложенные в разных странах пороговые значения МИКПТП являются плодом консенсуса между ведущими экспертами, а не результа­том точных расчетов. По мере накопления опыта их периодически пересматри­вают. Несмотря на определенную условность рекомендованных пороговых зна­чений МИК ПТП, они являются единственной основой для первого этапа ин­терпретации результатов оценки чувствительности МБТ к ПТП.

Биологические методы диагностики туберкулеза

Биологическая проба (биопроба). Биопроба является еще одним мето­дом выявления микобактерий. Для этого чувствительных к туберкулезу живот­ных (чаще всего морских свинок) заражают патологическим материалом, взя­тым от больного, и в течение 3 месяцев наблюдают за их весом, поведением, местными изменениями. Если в течение этого срока животное не погибнет, его забивают. Морских свинок, забитых или погибших, обязательно вскрывают и оценивают туберкулезные изменения, произошедшие в их органах животных при развитии специфического процесса. Даже при отсутствии специфических изменений для подтверждения диагноза из лимфатических узлов, легких, пече­ни, селезенки готовят мазки, которые окрашивают по Цилю-Нильсену. Кроме того, кусочки указанных органов гомогенизируют и высевают на питательные среды. В сомнительных случаях выполняют гистологическое исследование тканей. Чувствительность биологического метода выявления микобактерий вы­сока (несколько клеток МБТ на пробу). Однако в последнее время появились сообщения о том, что результат биологического исследования не всегда корре­лирует с данными клинико-рентгенологического обследования.

Определение вирулентности штаммов микобактерий. Как и в общей микробиологии, при туберкулезе под вирулентностью понимают степень пато­генное™, то есть способность штамма МБТ размножаться в организме хозяина и вызывать в нем специфические патоморфологические изменения. Вирулент­ность МБТ обусловливается биологическими особенностями возбудителя ту­беркулеза, с одной стороны, и степенью резистентности макроорганизма — с другой. Определенная степень вирулентности присуща конкретному штамму МБТ и является не видовым (как патогенность), а индивидуальным признаком. Наиболее чувствительными животными для определения вирулентности мико­бактерий туберкулеза являются морские свинки, обладающие слабой естест­венной защитой против туберкулезной инфекции.

Для изучения вирулентности микобактерий суспензию штамма МБТ вво­дят подкожно двум морским свинкам в паховую область и ведут наблюдение за их весом, поведением, местными изменениями. Погибших морских свинок вскрывают. Для оценки степени вирулентности МБТ используют несколько критериев. Один из них — продолжительность жизни лабораторных животных,

использованных в эксперименте. К высоковирулентным относят культуры, вы­бывающие гибель морских свинок от генерализованного туберкулеза в период до 45 дней после заражения, к средневирулентным — при гибели через 1,5-3 месяца, к слабовирулентным — при гибели через 3-5 месяцев и более. Виру­лентность культур МБТ можно оценивать также по степени пораженное™ внутренних органов, выраженной в баллах (по М.В. Триус). По этой схеме спе­цифические изменения в органах и лимфатических узлах зараженных свинок оцениваются в зависимости от степени их выраженности плюсами, которые за­тем переводятся в цифровые показатели. Одним плюсом обозначается наличие единичных очагов в органе (селезенке, печени, легком), тремя плюсами — то­тальное поражение, двумя — промежуточная степень поражения. При исследо­вании лимфатических узлов каждый плюс оцениватся в 1 балл, селезенки — в 2, печени — 3, легких — 4 балла. Таким образом, при максимальных специфи­ческих изменениях цифровое обозначение поражения выражается цифрой 30. Е.Ф. Чернушенко разработана схема макроскопической оценки поражения внутренних органов морских свинок, зараженных туберкулезом, согласно кото­рой максимальное поражение организма оценивается в 100 баллов. Эта схема позволяет проводить статистическую обработку результатов. Вирулентность культур микобактерий можно оценивать также по индексу пораженности, предложенному Mitchison. Данный индекс рассчитывают как квадратный ко­рень из отношения пораженности внутренних органов, выраженной в баллах, к числу прожитых животным дней. Такой способ оценки учитывает скорость раз­вития специфических поражений во внутренних органах лабораторных живот­ных. При величине индекса пораженности 1 и более штамм микобактерий от­носят к высоковирулентным.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Полимеразная цепная реакция. Получение более совершенных пита­тельных сред, разработка автоматических систем позволяют сокращать сроки выявления и идентификации микобактерий. Однако они все еще остаются дос­таточно длительными и зависят от количества возбудителя в инфекционном материале. Современные молекулярно-генетические методы открывают в этой области значительные перспективы, так как позволяют с высокой чувствитель­ностью и специфичностью проводить выявление и типирование микобактерий в различном диагностическом материале.

Наиболее часто на практике используется молекулярно-генетический ме­тод, в основе которого лежит принцип полимеразной цепной реакции (ПЦР).

ПЦР — принципиально очень простой метод амплификации, т. е. умно­жения нуклеиновых кислот. Он был открыт в середине 1980-х гг. Kary Mullis с соавторами (биотехнологическая компания «Cetus», США). За это открытие ав­тор был удостоен Нобелевской премии. В последние годы ПЦР становится од­ним и) наиболее широко используемых в современной медицине и биологии методов. И частности, в настоящее время выпускаются диагностические наборы кии НЦ1\ которые используются для выявления ВИЧ, вируса гепатита С, ЦМВ,

микобактерий туберкулеза и т. д. в различных диагностических материалах. ПЦР имитирует естественный процесс репликации ДНК, при котором число ее молекул удваивается после каждого цикла. Одно из отличий заключается в том, что ПЦР используется для амплификации не всей хромосомы, а лишь неболь­шого участка ДНК, специфичного для данного вида (последовательность-мишень).

Как известно, при репликации одна цепочка ДНК служит матрицей, на которой с помощью ДНК-полимеразы синтезируется комплементарная ей вто­рая цепочка. Удвоение ДНК с помощью полимеразы происходит от 5′- кЗ’-концу каждой цепочки. Названия «3’» и «5′-конец ДНК» обусловлены по­следовательностью соединения нуклеотидов в цепочке. Направленность цепей в двухцепочечной молекуле ДНК противоположна, т. е. 3′-конец одной цепочки всегда взаимодействует с 5′-концом второй цепочки. Противоположную на­правленность цепей часто выражают термином «антипараллельность». При продвижении ДНК-полимеразы по молекуле ДНК на одной цепочке сразу син­тезируется сплошная комплементарная цепь, на другой происходит синтез не­больших фрагментов ДНК, получивших название фрагментов Оказаки, которые затем сшиваются при помощи фермента лигазы. Для начала работы ДНК-полимеразы необходим участок двухцепочечной ДНК, с которого начинается репликация. Небольшой участок РНК, с которого начинается удвоение ДНК, получил название праймера, или затравки.

Метод ПЦР основан на повторении трех этапов, проходящих при разных температурных режимах. На первом этапе двухцепочечную ДНК денатурируют путем кратковременного нагрева инкубационной системы до 90-95°С. Таким образом, две цепочки ДНК остаются в растворе в не связанном друг с другом состоянии до тех пор, пока температура не будет понижена. На следующем этапе, получившем название этапа отжига праймеров, который проходит при 40-60°С, с участками одноцепочечных молекул ДНК, фланкирующими после­довательность-мишень, связываются праймеры. Это короткие участки РНК длиной около 20 нуклеотидов. Каждая из затравок связывается только с одной цепочкой ДНК. Следующий шаг ПЦР — умножение последовательности-мишени с помощью полимеразы. Поскольку инкубационная система на этапе денатурации нагревается до 90-95°С, в ПЦР используется термостабильная Taq-полимераза, выделенная из Thermits aquaticus. Этап достройки затравок проходит при 70-75°С. На этом заканчивается первый цикл амплификации. Да­лее все этапы повторяются 20-25 раз. В результате количество ДНК-мишени возрастает в геометрической прогрессии.

На практике из патологического материала, взятого от больных, при по­мощи специальных методов выделяют ДНК. К ней добавляют реакционный буфер, смесь нуклеозидтрифосфатов, праймеры, полимеразу и проводят ам­плификацию в программируемом термостате (термоциклере). Результат учиты­вают с помощью электрофореза в агарозном геле или с помощью иммобилизо­ванных фрагментов ДНК. Присутствие в пробе последовательности-мишени свидетельствует о наличии МБТ в исследуемом образце. ПЦР позволяет выяв-

Пять 1-10 бактериальных клеток в 1 мл биологического материала. Специфич­ность реакции — 97-98%.

Исследованию методом ПЦР подлежат мокрота, бронхиальный секрет, плевральная и другие жидкости, моча, периферическая и менструальная кровь, соскобы эпителиальных клеток цервикального канала.

Следует отметить, что с помощью ПЦР нельзя определить активность ту­беркулезного процесса, поэтому интерпретировать полученный результат необ­ходимо с учетом клинико-рентгенологических данных. Метод ПЦР можно ис­пользовать как дополнительный диагностический метод при дифференциаль­ной диагностике в комплексе с другими методами лабораторной диагностики туберкулеза и нельзя использовать в качестве скринингового метода для выяв­ления больных туберкулезом из-за возможности ложноположительных резуль­татов. Кроме того, препятствием для широкого использования данного метода служит необходимость использования дорогостоящего оборудования и диагно­стических наборов.

ПЦР — не единственный амплификационный метод детекции микобак-терий. В табл. 5 представлены другие амплификационные методики, позво­ляющие обнаруживать микобактерии.

Таблица 5 Амплификационные методы, используемые для детекции микобактерии

Трехэтапный температурозависимый синтез двухцепочечной ДНК

источник