Иммунохроматографический метод в исследовании туберкулеза

Иммунохроматографический тест для качественного определения антител к возбудителю туберкулёза в цельной крови, сыворотке или плазме крови

За 1-2 дня до исследования исключить из рациона продукты с высоким содержанием жиров. За 2 дня до сдачи крови на вирусные гепатиты исключить из рациона цитрусовые, оранжевые фрукты и овощи.

Результаты исследований на наличие инфекций зависят от периода инфицирования и состояния иммунной системы, поэтому отрицательный результат полностью не исключает инфекции. На раннем этапе заболевания происходит сероконверсия (отсутствие антител в острый период заболевания).

В сомнительных случаях целесообразно провести повторный анализ спустя 3-5 дней.

Исследование крови на наличие антител классов IgG не ранее 10-14 дня. Это связано со сроками выработки антител иммунной системой и появлением их в крови в диагностическом титре

Это качественный иммунотест для выявления противотуберкулёзных антител(изотипы IgG, IgM ,IgA) в пробах цельной крови, сыворотки или плазмы.

Туберкулез — это инфекционное заболевание, распространяемое воздушным путем. Источником инфекции являются люди с легкими, пораженными туберкулезом (легочным туберкулезом).

Лабораторную диагностику следует проводить при:

пневмонии у больного с алкогольной поливисцеропатией
деструктивной пневмонии
кровохаркании
пневмонии у пациента с сахарным диабетом
у пациента с неблагополучным социальным статусом
у пациента с полисегментарной пневмонией
пневмонии, резистентной к стандартной антибактериальной терапии
подозрении на внелегочный туберкулез (лихорадка неясного генеза, мочевой синдром неясного генеза и др.)

Повышенную утомляемость, особенно во второй половине дня
Снижение аппетита,
Появление необычной для него потливости днем или по ночам,
Похудание
Кашель сухой или со скудным выделением светлой пенистой мокроты.
Кашель при туберкулёзе легких нередко появляется с самого начала болезни и продолжается затем без перерыва. Усиление кашля у больных туберкулёзом наблюдается после глубоких вдохов, после громкого и продолжительного разговора.
Кровохарканье или легочное кровотечение.
Боли в груди при дыхании и кашле.
Одышка.
Длительная, стойкая субфебрильная температура.

Этот тест укажет только на присутствие антител к возбудителю туберкулёза в образце и не может быть использован в качестве единственного критерия для постановки диагноза. Как и в случае любых других диагностических тестов, все результаты необходимо рассматривать совместно с остальной клинической информацией, доступной врачу. Если результат теста отрицательный, но сохраняются клинические симптомы, рекомендуется провести дополнительное обследование.

источник

Туберкулез — хроническое инфекционное заболевание, вызываемое микобактерией туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). Микобактерия была открыта в 1882 году немецким бактериологом Р. Кохом, поэтому ее часто называют палочкой Коха.

Микобактерии туберкулеза широко распространены в окружающей среде. Носителями и источником инфекции являются больные люди и крупный рогатый скот. Заражение чаще происходит через дыхательные пути и реже — алиментарным путем.

После проникновения в организм человека микобактерии инфицируют макрофагов, образуя в дальнейшем микобактериальные фагосомы. Микобактерии противодействуют дальнейшему превращению фагосомы, нарушая процессы лизиса бактериальной клетки. Такой механизм защиты позволяет микобактериям выживать в клетках хозяина. Находясь в макрофаге, микобактерии размножаются. После гибели макрофага, бактерии попадают во внеклеточную среду. Дальнейшее существование бактерий зависит от иммунных свойств организма — активности макрофагов и Т-лимфоцитов.

К роду микобактерий относится несколько десятков видов. Основную угрозу для здоровья людей несут микобактерии человека (Mycobacterium tuberculosis) и микобактерии бычьего типа (Mycobacterium bovis). Кроме них, патогенными свойствами обладают микобактерии Mycobacterium africanum, М. microti, М. canetti, М. caprae, М. pinnipedii. Эти виды проводят к развитию туберкулеза человека с его типичными клиническими и морфологическими признаками. Перечисленные микобактерии составляют, так называемый, комплекс туберкулезных микобактерий (МТВС). Выделяют также Мycobacterium avium complex (M.avium, М. avium paratuberculosis и др.). В него входят бактерии, вызывающие диссеминированные процессы внелегочной локализации у человека.

К нетуберкулезным видам микобактерий, приводящих к развитию микобактериозов, относятся такие виды, как Mycobacterium chelonae, M. kansassi, M. xenopi и другие. Эти микобактерии вызывают заболевания легких, похожие на туберкулезный процесс, однако они более эффективно поддаются лечению противотуберкулезными средствами.

Один из видов микобактерий вызывает другое серьезное заболевание — лепру. Возбудителем в этом случае является Mycobacterium leprae.

Микобактерии чрезвычайно устойчивы во внешней среде. В высохшей мокроте и в пыли они могут находиться до 1 года, в почве до полугода. Их высокая устойчивость создает значительные трудности в борьбе с этой инфекцией.

Важной особенностью микобактерий является их свойство долгое время находиться в организме человека в латентном состоянии. При определенных ситуациях латентная фаза, протекающая без клинических проявлений, может перейти в активную форму. Скрытое протекание инфекции и стертость клинических проявлений существенно затрудняют раннюю выявляемость заболевания. Именно поэтому диагностика латентного туберкулеза является крайне важной.

Разработано большое количество лабораторных тестов для идентификации микобактерий туберкулеза в различных биологических жидкостях и тканях. Основными являются микроскопия биологических жидкостей с окраской мазков по Цилю-Нильсену, бактериологический посев, серологические методы исследования, применение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Микроскопический способ выявления микобактерий основан на их способности окрашиваться в красный цвет при использовании специальных красителей, тогда как другая микрофлора приобретает при этом синий цвет. Недостатком метода является его низкая чувствительность, поскольку для выявления микобактерий требуется их достаточное содержание в исследуемом образце. Повышение чувствительности микроскопического метода можно увеличить, применяя люминисцентную микроскопию.

Высокочувствительными методами диагностики туберкулеза являются серологические методы диагностики. После встречи человека с бациллой туберкулеза, как и с любым другим чужеродными агентом (вирусы, бактерии, глистная инвазия), иммунная система человека начинает вырабатывать специфические белки — антитела, блокирующие жизнедеятельность бактерий. Так осуществляется один из видов защиты организма человека от многочисленных болезнетворных микробов и вирусов.

После внедрения бактерий туберкулеза клетки иммунной системы начинают вырабатывать специфические антитела различных классов — IgM, IgA, IgG, которые циркулируют в кровеносном русле. На обнаружении таких специфических антител построена серологическая диагностика туберкулеза.

К основным современным методам серологической диагностики относятся тест-системы, основанные на технологиях, использующихся в иммунохимии — ИФА (иммуноферментное исследование), РИА (радиоиммунный анализ), иммунохроматографические методы (Hexagon TB, TB Check-1), иммуноблот. Повышение чувствительности методов ИФА постепенно приводят к вытеснению дорогостоящих радиоиммунных методов в диагностике туберкулеза.

Первыми антителами, появляющимися в крови, являются антитела класса IgM. Как правило, они выявляются в сыворотке крови через 2-3 недели после встречи с инфекцией и могут обнаруживаться на протяжении двух лет. Большинство тестов на основе ИФА технологий разработано для выявления антител класса IgG и суммарных антител (IgG + IgA + IgM).

Метод иммуноблота относится к подтверждающим методам диагностики наличия инфекционного процесса, поскольку позволяет выявлять одновременно несколько видов антител различных классов иммуноглобулинов к различным белкам бактерий. Разновидностью иммуноблота можно считать метод TB-Spot, где в качестве антигенов используются два вещества, довольно специфичных именно для микобактерий (липоарабиноманнан и белок весом 38 кДа). При наличии антител к микобактериям туберкулеза в сыворотке крови происходит их связывание с данными белками, сопровождающееся характерной окраской.

Микобактерия туберкулеза имеет в своем составе различные вещества (антигены), на которые организм человека вырабатывает антитела. Чем специфичнее/уникальнее бактериальный антиген, тем специфичнее будут образоваться на этот антиген антитела. Проблема повышения специфичности состоит в обнаружении таких антигенов и создании высокоспецифичных ИФА тест-систем для диагностики туберкулеза. Одним из таких белков, применяющихся в одностадийной тест-системе, является белок А60, специфичный для микобактерии. Этот белок после специальной очистки фиксируется на мембране. После добавления сыворотки больного человека и наличия в ней антител происходит их связывание с белком. Место связывание окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Применение иммуноферментных методов исследования является важным приемом в диагностике латентного туберкулеза. Выявление антител при помощи иммуноферментных технологий возможно не только в сыворотке крови, но и в моче, плевральной жидкости, мокроте, спинномозговой жидкости.

Бактериологический метод (посев материала на специальные среды) обнаружения микобактерий туберкулеза является высокоспецифичным методом, но имеет существенный недостаток: для идентификации бактерии при посеве на классические среды требуется около 4-8 недель. Этот способ выделения микобактерий обладает большей чувствительностью по сравнению с микроскопическим методом и позволяет после обнаружения микобактерий провести исследование по определению чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Применение новых питательных сред и специализированного бактериологического оборудования позволяет определить рост микобактерий уже через 2 недели.

После расшифровки ДНК микобактерий туберкулеза и введения в лабораторную практику метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), данный способ стал широко применяться в диагностике этого заболевания. Метод высокоспецифичен и позволяет проводить исследования небольшого количества материала. По оценкам ряда исследователей, метод ПЦР по чувствительности и специфичности превосходит культуральный метод диагностики при внелегочных формах туберкулеза.

Цитологические и гистологические методы диагностики туберкулеза позволяют выявить характерные морфологические признаки наличия заболевания. Обнаружение клеток Лангханса может свидетельствовать о наличии туберкулеза. Следует учитывать, что эти клетки могут появляться и при других инфекционных заболеваниях — саркоидозе, сифилисе, бруцеллезе.

Одним из самых ранних методов диагностики туберкулеза является реакция Манту (с 1908 года). Суть этой реакции заключается во введении внутрикожно туберкулина, представляющего собой очищенную смесь убитых культур микобактерий человека и бычьего вида. Результат пробы оценивают по величине инфильтрата через трое суток.

Современное развитие иммунологии и иммунохимии привело к внедрению новых тестов в диагностике туберкулеза — «диаскинтест» и «квантифероновый тест».

Проведение диаскинтеста заключается во внутрикожном введении двух белков, присутствующих у микобактерий опасных для человека, с последующей оценкой реакции в месте введения.

Квантифероновый тест проводится в пробирке крови взятой у пациента. Тест основан на способности белков, выделенных из микобактерий туберкулеза, стимулировать выработку гамма-интерферона сенсибилизированными Т-лимфоцитами человека, то есть инфицированного пациента.

Накопленный опыт в лечении туберкулеза свидетельствует о трудностях диагностики этого заболевания. Применение одного метода часто бывает недостаточно, поэтому существует необходимость использования различных приемов из арсенала инструментальных и лабораторных способов. Следует учитывать, что каждый из методов имеет свои недостатки, а их сочетание может привести к более достоверному заключению.

источник

Оценка иммунохроматографического теста на дискриминацию комплекса Mycobacterium tuberculosis и не туберкулезных микобактерий в клинических изолятах от внелегочного туберкулеза

Точная диагностика туберкулеза (ТБ) имеет решающее значение для облегчения раннего лечения пациентов и сокращения его распространения. Клиническая презентация комплекса Mycobacterium tuberculosis (MTBC) и не туберкулезных микобактерий (NTM) может быть или не быть одинаковой, но режим лечения всегда различен для обеих инфекций. Дифференциация между MTBC и NTM обычными лабораторными методами занимает много времени и громоздка. Это исследование было направлено на оценку иммунохроматографического теста (ИКТ) на основе мышиного моноклонального анти-MPT64 для простой и быстрой дискриминации между MTBC и NTM в клинических изолятах из случаев внелегочного туберкулеза.

Всего у пациентов, подозреваемых в наличии внелегочного туберкулеза, было собрано в общей сложности 800 клинических образцов. Предварительная диагностика проводилась путем прямого окрашивания Ziehl-Neelsen (ZN) с последующей культурой в системе BACTEC. Всего для скрининга с помощью теста ИКТ были отобраны 150 клинических изолятов, которые были обнаружены в системе BD 460 ТБ в сентябре 2009 года по сентябрь 2010 года. Тест p-nitro-α-ацетиламино-β-гидроксипропиофен (NAP) проводили для дифференцировки MTBC и NTM. M. tuberculosis был дополнительно подтвержден ПЦР IS6110 культуральных положительных изолятов BACTEC, который служил эталонным методом идентификации MTBC и сравнительной оценки набора ИКТ.

Из 150 положительных изолятов культуры BACTEC, проверенных комплектом ИКТ, 101 (67,3%) были признаны положительными для MTBC, а остальные 49 (32,7%) считались НТМ. Эти результаты были дополнительно подтверждены ПЦР IS6110, который служил эталонным методом для обнаружения MTBC. Контрольный штамм H37Rv принимался за контроль теста ИКТ и ПЦР IS6110. Эталонный штамм показал наличие антигенной полосы MPT64 в тесте ИКТ. Аналогичные полосы были сформированы в 101 из 102 тестируемых изолятов MTBC, доказав 99,1-процентную чувствительность, и не было обнаружено полос в 48 (100%) изолятах NTM, что доказывает 100-процентную специфичность набора ИКТ.

Наши результаты показывают, что тест на ИКТ может использоваться на образцах с прямой культурой. Он не требует специального оборудования, прост и занимает меньше времени. Он может легко различать МТБК и НТМ и, таким образом, может помочь в надлежащем лечении туберкулеза.

Туберкулез (ТБ) является одной из основных причин заболеваемости и смертности во всем мире. В Индии ежегодно регистрируется около 1,8 миллиона новых случаев заболевания туберкулезом, на долю которых приходится пятая часть новых случаев в мире — больше, чем в любой другой стране1. Ситуация еще более усугубляется растущим числом лекарственно-устойчивых случаев туберкулеза. Таким образом, существует потребность в быстрой и правильной идентификации микобактерий и экспресс-теста на чувствительность к лекарственным средствам для эффективного лечения этого заболевания. Стратегии, используемые для клинического лечения пациентов с микобактериальным туберкулезным комплексом (MTBC) и не туберкулезными микобактериями (NTM), различны, поэтому для подходящего управления необходимо быстрое обнаружение, изоляция и дискриминация23. Хотя обычные биохимические методы способны идентифицировать микобактериальные виды; но это утомительно, требует много времени и требует сложных мер предосторожности. Недавняя цель Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) заключается в том, чтобы сократить время обнаружения культуры, идентификации и обнаружения лекарственной устойчивости до двух дней с помощью анализа проб линии. Хотя молекулярные методы идентификации очень точные и надежные, но требуют специализированного, сложного и дорогостоящего оборудования, обученного лабораторного персонала и дорогостоящего для стран с ограниченными ресурсами5. В последние годы были достигнуты значительные успехи в понимании генетической структуры микобактерий. Разработаны различные генетические зонды и системы амплификации для диагностики туберкулеза, и некоторые из них доступны в виде коммерческих наборов для прямого обнаружения и идентификации M. tuberculosis в клинических образцах67. Ранняя и надежная идентификация микобактерий может избавить пациентов от ненужных методов лечения в случае NTM8. Исследования показали, что M. tuberculosis protein 64 (MPT 64) специфичен для MTBC, включая M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis и некоторые, хотя и не все, субстраты M. bovis BCG59-12. MPT 64 представляет собой специфический антиген комплекса M. tuberculosis, секретируемый во время бактериального роста, и является отличным антигеном для идентификации MTBC912. Это исследование было проведено для оценки клинической пользы набора иммунохроматографических тестов (ИКТ) на основе мышиного моноклонального анти-MPT 64 для простой дискриминации между комплексом M. tuberculosis и не туберкулезными микобактериями в клинических изолятах у пациентов с внелегочным туберкулезом.

Это проспективное исследование было проведено в Лаборатории микобактериологии, кафедре микробиологии, Санджай Ганди, аспирант Института медицинских наук, Лакхнау, Индия. Образцы были собраны из больницы грудной клетки Kasturaba, отдела легочной медицины, медицинского университета Chhatrapti Shahuji Maharaj, Лакхнау, Индия, а также из различных отделений Института медицинских наук Санджай Ганди, Лакхнау, Индия. Всего 800 клинических образцов (2-10 мл) в виде аспирата лимфатических узлов и холодных абсцессов, плевральной жидкости, цереброспинальной жидкости (CSF), синовиальной жидкости, асцитической жидкости, мочи, желудочного аспирата, гноя, аспирата костного мозга, мазков намотки и биопсийных материалов были собраны из подозреваемых случаев внелегочного туберкулеза в период с сентября 2009 года по сентябрь 2010 года. Исследование было одобрено комитетом по институциональной этике медицинского университета Chhatrapati Shahuji Maharaj, Лакхнау, Индия. Возраст пациентов варьировался от 12 до 65 лет и включал как мужчин, так и женщин в городских и сельских поселениях. Письменное информированное согласие было получено от субъектов до поступления в исследование.

Микробиологический анализ для M. tuberculosis: для дезактивации образцов из нормальной бактериальной флоры образцы обрабатывали методом N-ацетил-L-цистеин-NaOH13. Мазки окрашивали Ziehl-Neelsen (ZN) для обнаружения кислотоустойчивых бацилл (AFB). Для метода BACTEC (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, USA) 0,5 мл обработанного образца инокулировали в флакон BACTEC 12B, дополненный PANTA (смесь из пяти различных антибиотиков: полимиксин B, амфотерицин B, налидиксовая кислота, триметоприм и азлоциллин ) и инкубировали при 37 ° С. Чтения проводились два раза в неделю в течение первых двух недель и после этого после этого для положительного результата культуры в течение 8 недель. После 8 недель, если индекс роста (GI) был равен нулю, образцы считались отрицательными. Мазки AFB были сделаны из флаконов с GI 50-100, а дальнейшая идентификация MTBC проводилась с помощью теста дифференцировки BACTEC NAP (p-нитро-α-ацетиламино-β-гидроксипропиофенон) (Becton Dickinson, Sparks, MD, USA ) 14.

Молекулярное подтверждение комплекса M. tuberculosis по ПЦР IS6110: окончательное подтверждение MTBC было выполнено ПЦР IS6110 культуральных положительных изолятов BACTEC. Экстракцию ДНК проводили методом экстракции бромида цетил-триметиламманийбромида (CTAB) -фенолхлороформа15. Идентификацию MTBC проводили с использованием конкретной пары праймеров, предназначенных для усиления последовательности вставки IS6110 (

123-bp). Последовательностью этих праймеров FP1 и RP2 были: 5′-CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG3 ‘и 5’ CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG 3 ‘, соответственно16. ПЦР-реакционная смесь (20 мкл) содержала 2 × Pyrostart Fast PCR Master Mix (Fermatas, Индия), 10 пмоль каждого праймера (SBS Gentech Co. Ltd., Индия) и 5 мкл экстрагированной ДНК. Амплификацию проводили в термоциклере (MJ Research, PTC-100 Thermal Cycler, GMI, Inc, USA), который включал 40 циклов денатурации при 94 ° С в течение 2 мин, отжиг праймеров при 68 ° С в течение 2 мин, и удлинение праймера при 72 ° С в течение 1 мин. Амплифицированные продукты разделяли на 2% агарозные гели, визуализированные на ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Bangalore Genei, Bangalore, India). Наличие фрагмента 123bp показало положительный тест на комплекс M. tuberculosis. Положительный контроль включал ДНК эталонного штамма H37Rv, а отрицательный контроль включал воду класса ПЦР (фиг.1).

IS6110PCR-обнаружение комплекса M. tuberculosis. Электрофоретическое разделение ампликона на 2% агарозный гель регистрируется на полосах 1-7. Наличие ампликона 123 bp в дорожках 3, 4, 5, 7 указывало на присутствие мишени, в то время как отсутствие ампликона в полосе 6 показало отсутствие мишени. Дорожка 2 была отрицательной, а полоса 1 была положительной (H37Rv). L-Ladder 100 bp хорошо показан.

Тест на туберкулез в ИКТ: Объем 100 мкл бульона из культуры BACTEC добавляли в лунку SD TB Ag MPT 64 Rapid ICT kit cassette (Standard Diagnostics Ltd., Корея). Инокулированные кассеты ИКТ выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин и исследовали на наличие контрольных и тест-полос. Внешний вид полосы в области «C» подтвердил достоверность теста. Дополнительный внешний вид полосы в области «Т» был интерпретирован как положительный для антигена MPT 64 (рис.2). Никакая группа в области «C» не была интерпретирована как недействительный тест. Стандартный контрольный штамм H37Rv использовался в качестве положительного контроля.

Идентификация M. tuberculosis комплекса MPT64 Rapid ICT kit.

Статистический анализ: данные были проанализированы с использованием SPSS 15.0 (Статистический пакет для социальных наук, Чикаго, Иллинойс, США) для Windows. Действительность теста ИКТ рассчитывалась по чувствительности и специфичности. Чувствительность рассчитывалась как [Tp / (Tp + Fn)] × 100; специфичность рассчитывалась как [Tn / (Tn + Fp)] × 100; Tp = общее количество положительных значений; Tn = общее количество негативов; Fp = общее число ложных положительных, Fn = общее число ложных отрицательных, соответственно.

Из 800 испытуемых образцов было обнаружено, что 150 (18,7%) были положительными по методу культивирования BACTEC. Из этих 150 положительных положительных результатов BACTEC 20 (13,2%) были обнаружены мазком положительным для AFB. Все положительные случаи культуры BACTEC были исследованы методом NAP для дифференциации между MTBC и NTM, а 102 (68%) были положительными для MTBC по тесту NAP, остальные 48 (32%) считались НТМ. Окончательное подтверждение MTBC в положительных изолятах BACTEC было выполнено ПЦР IS6110. Все 102 положительные изоляты NAP были признаны положительными как MTBC, а остальные 48 были отрицательными по ПЦР IS6110 (фиг.3). Тест ИКТ был проведен на 150 положительных изолятах BACTEC на 1 и 5 день положительных флаконов культуры BACTEC. В тесте ИКТ на 5-й день положительные флаконы культуры BACTEC смогли дать заметно более интенсивную полосу по сравнению с 1-м днем положительных флаконов с культурой BACTEC, которые можно было бы объяснить низкой концентрацией антигена в начальный день инокуляции. Контрольная полоса в области «C» тестовой кассеты ИКТ была замечена во всех 150 проверенных образцах (рис.2), и ни один тест не был признан недействительным. Контрольный штамм H37Rv показал появление полосы в тестовой области («T»), подтверждающей способность теста ИКТ для обнаружения антигена MPT64. В общей сложности 101 из 150 (67,3%) тестируемых изолятов показали темную полосу в тестовой области («T»), подтверждающую наличие антигена MPT 64 и, следовательно, присутствие MTBC. Один образец, который был найден положительным для MTBC по тесту NAP, но был отрицательным с помощью ИКТ, может быть связан с низкоуровневой экспрессией антигена. Остальные 49 (32,7%) изолятов, которые были идентифицированы как NTM с помощью теста NAP, не показали образования полосы, что указывает на отсутствие антигена MPT64 в этих изолятах. Было установлено, что чувствительность и специфичность набора ИКТ составляют 99,1 и 100% соответственно (таблица).

Сравнение методов выявления комплекса M. tuberculosis в случаях внелегочного туберкулеза. * Тест NAP и отрицательные изоляты ПЦР IS6110 были включены в микобактерии без туберкулеза. MTBC, Mycobacterium tuberculosis complex; NTM, не туберкулезные микобактерии.

Чувствительность и специфичность результатов теста MPT64 по сравнению с ПЦР IS6110

M. tuberculosis создает диагностические и терапевтические проблемы из-за низкой чувствительности диагностических средств, доступных для идентификации и дискриминации с помощью NTM. Обычная культура занимает много времени и не имеет чувствительности; мазок для AFB является быстрым, но чувствительность еще не оценивалась и не отличает MTBC и NTM17. Задержка диагностики может повлиять на лечение18. Быстрая идентификация микобактерий важна и необходим простой, чувствительный и конкретный метод идентификации. Обычные методы, такие как прямое окрашивание колонии, просты и быстры, но не различают M. tuberculosis и NTM, тогда как традиционные биохимические тесты занимают много времени. Новые методы, такие как хемилюминесцентные ДНК-зонды, амплификация нуклеиновой кислоты, высокоэффективная жидкостная хроматография и секвенирование генов 16S рРНК являются более сложными методами, но не являются экономически эффективными и требуют дорогостоящего оборудования19-21. Attorri et al. 22 показали, что M. tuberculosis часто проявляет серпентиновую конформацию при выращивании в жидкой среде, NTM может образовывать истинные корды в жидкой культуре, но делать это редко, несмотря на то, что многие виды содержат гликолипид клеточной стенки, который опосредует образование корней. Предыдущие исследования23-25 использовали образование пуповины для экономически эффективного использования ДНК-зондов для идентификации видов Mycobacterium. Chihota и соавт. 5 сообщили о стоимости идентификации организма на положительную культуру в BACTEC как 35,94 долларов США, используя стандартные биохимические тесты, 15,49 долларов США для анализа против MPB64 и 2,28 доллара США для записи. Экономически эффективные аналитические исследования26 теста SD MPT64 TB Ag, другие быстрые молекулярные методы и культура в сочетании с обычными биохимическими испытаниями показали, что SD MPT 64 TB Ag ICT более экономичен, чем два других метода. Кроме того, ИКТ требует всего 20 минут анализа по сравнению с пятью днями испытаний NAP. Исмаил и др. 27 сообщили, что чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные предсказательные значения набора SD AgMPT64 составляют соответственно 97, 100, 100 и 92 процента. Используя тот же набор, Chihota и соавт. 5 сообщили о чувствительности и специфичности 100% в общей сложности 108 сортовых культур. В настоящем исследовании чувствительность и специфичность набора ИКТ составляли соответственно 99,1 и 100%. Изоляты MTBC показали такую же полосу, что и контрольный штамм H37Rv.

В заключение, тест ИКТ может быть использован на образцах с прямой культурой, он не требует специального оборудования. Он может различать MTBC и NTM. Низкая стоимость, простота, быстрота, высокая чувствительность и высокая специфичность для обнаружения антигена MPT 64 делают ИКТ полезным диагностическим инструментом для дифференциации диагностики MTBC и NTM и могут помочь в надлежащем лечении туберкулеза.

Эта работа была поддержана грантом исследований от Индийского совета медицинских исследований в Нью-Дели. Авторы благодарят Шри Хариома Верму и г-жу Джойти Умаро за техническую поддержку в ходе исследовательской работы.

Конфликт интересов: авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

источник

Большое значение в правильности выполнения лабораторных поисков МБТ имеет забор патологического материала.Посуда, в которую собирают патологический материал,должна быть стерильной. Наиболее часто исследуется мокрота. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Если такой возможности нет, материал сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4-10 о С. Если лаборатория расположена в отдалении от учреждения здравоохранения, доставку материала для исследований осуществляют 1 или 2 раза в неделю. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого.

При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении/кабине.

Мокроту на МБТ в амбулаторных условиях собирают трижды, после соответствующего туалета полости рта:

1. Первая проба – в поликлинике или стационаре, в присутствии медицинского работника, через 1-2 часа после сна.

2. Вторая проба – в тот же день через несколько часов (3-4 часа).

3. Третья проба – на следующий день пациент приносит мокроту сам.

У нетранспортабельных пациентов забор мокроты производит участковая медсестра поликлиники на дому в стерильную посуду и доставляет в бактериологическую лабораторию.

Методы этиологической диагностики туберкулеза

– с окраской по Циль-Нельсену;

– посевы на плотные питательные среды (Левен-

– посевы на жидкие питательные среды с автома-

тизированным учетом роста типа BACTEC MGIT 960/320 TB

Биочиповая, стриповая, картриджная технологии,

ПЦР в режиме реального времени

Рис. 2. Алгоритм этиологической диагностики туберкулеза

Цель этиологической диагностики туберкулеза:

• выявление эпидемиологически опасных больных туберкулезом – бактериовыделителей (с МБТ+);

• верификация диагноза туберкулеза;

• определение лечебной тактики;

• оценка эффективности лечения и прогноза;

• для эпидемического контроля за туберкулезом.

Бактериоскопический метод выявления МБТ наиболее простой, дешевый, специфический, доступный по сравнению со всеми другими методами диагностики туберкулеза. Бактериоскопический метод имеет свои разновидности: простая бактериоскопия иLEDили люминесцентной микроскопии (рис. 3).

При простой бактериоскопии мазок красят по Цилю-Нильсону: стеклянной палочкой гнойные комочки мокроты наносят равномерно на предметное стекло, и фиксируют в пламени горелки. Далее красят карболовым фуксином, который после нанесения подогревают в пламени, чтобы краситель лучше проник в МБТ, после промывания мазка обесцвечивают в 25 % растворе сернойкислоты или в 3 % соляно-кислом спирте. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3 % раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы – в голубой цвет. МБТ под микроскопом имеют вид продолговатых палочек, розового цвета на синем фоне. На окрашивание затрачивается 20-30 минут. Метод простой и дешевый, но мало информативный, чтобы обнаружить МБТ в 1 см 3 мокроты должно быть около 50-100 тыс. МБТ, если же будет меньше, то МБТ не будут найдены.

В основу метода люминесцентной микроскопии включена окраска МБТ флюорохромами (аурамин, родамин и др.), которые также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки и светятся в ультрафиолетовых лучах. LED (light emitted diode – светоизлучающие диоды) технологии позволяют конвертировать обычный световой микроскоп во флюоресцентный, увеличивая и улучшая технические возможности люминесцентной микроскопии.

При бактериологическом исследовании патологический материал культивируют на питательных средах, и выделяют культуру МБТ в чистом виде. Наиболее часто используют следующие питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финн-2. Перед посевом на питательные среды проводят обработку патологического материала для уничтожения сопутствующей флоры, разжижения, деконтаминации. В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты. Для мокроты в основном используют 10 % раствор трёхзамещённого фосфорно-кислого натрия. После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии, и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации, и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования, так как микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала (рис. 2). При использовании плотных сред инокулированные пробирки помещают в термостат при температуре 37 С на 2 суток в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 суток пробирки переводят в вертикальное положение, и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37 о С в течение 10-12 недель при регулярном еженедельном просмотре.

на среде Левенштейна-Йенсена

Рис. 3 Вид МБТ под микроскопом и в культуре

Длительность получения результатов исследований на основе классических метод выявления/культивирования микобактерий туберкулеза (в течение 1-3 месяцев) неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при наличии ЛУ у возбудителя и риском расширения спектра устойчивости МБТ.

Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов – ускоренный культуральный диагностический метод (10- 14 дней)

Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБТ примерно на 10% по сравнению с твердыми средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБТ, которые позволяют значительно ускорить получение результат. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.

Рис. 3. Автоматизированная система культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960

Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований.

В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT (mycobacteria growth indicating tube). Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка для стимуляции роста МБТ. На дне пробирки содержится кислородзависимый флюорохромный краситель. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода возникает флюоресценция. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC MGIT 960/320 (рис. 4). Один раз в час флуоресцентный сенсор считывает результаты тестирования. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU –growth units). В среднем появление роста МБТ сокращается до 11 дней. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).

Результат

незначительное или полное отсутствие свечения

Результат

на дне пробирки и оранжевое отражение в колене пробирки

Рис. 4. Результаты индикаторной пробирки MGIT на выделения культуры МБТ

Основное преимущество исследований на основе молекулярно-генетических методов в том, что они являются «быстрыми» методами, позволяющими получить результаты в относительно короткий временной период. Заключение о наличии МБТ в диагностическом материале делается на основании выявления видоспецифичного генетического маркера (ДНК) МБТ или видоспецифичных белков-антигенов, а вывод о ЛУ — на основании выявления мутаций в целевых участках генов МБТ, ассоциированных с ЛУ.

Из всех молекулярно-генетических подходов базовым методом, применяемым для выявления M.tuberculosis complex является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Проведение ПЦР-анализа происходит в три этапа:

Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции (табл. 3).

Варианты проведения амплификации и визуализации результатов ПЦР

Визуализации результатов ПЦР

ПЦР с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации

ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на стрипах

ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на биологических микрочипах

ПЦР с определением специфического продукта по значению флуоресценции специфического зонда в конечной точке

ПЦР в режиме реального времени (получение результатов непосредственно во время прохождения реакции)

Выделение ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом – сложный многоэтапный процесс, который может производится вручную или с использованием автоматов для выделения.

Амплификация ДНК. Для осуществления амплификации ДНК используются так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК МБТ, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только МБТ. В большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в многочисленных штаммах МБТ имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование – ПЦР–термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе и составляет 2 часа.

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флюоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК МБТв забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

Одной из инновационных технологий, основанных на ПЦРв режиме реального времени, является использование анализатора Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Этим оборудованием оснащены многие противотуберкулезные учреждения РФ. Она упрощает молекулярное тестирование, обеспечивая полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и детекция), необходимых для молекулярного тестирования. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНКM. tuberculosis. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину. Перекрестная реактивность с нетуберкулезными микобактериями отсутствует. ДНК МБТ, устойчивая к рифампицину выявляется в присутствии, как нетуберкулезных ДНК, так и в смешанных чувствительных и устойчивых штаммах. Образцы материала человека в основном могут быть взяты из мокроты, промывных вод бронхов, мочи, плеврального экссудата, ликвора. Итоговые результаты тестов предоставляются в графическом и табличном форматах (рис. 5). Xpert MTB/RIF позволяет сразу при подозрении у пациента туберкулеза взять у него мокроту и в течение двух часов определить есть ли у него МБТ и устойчивые ли они к самому эффективному противотуберкулезному препарату (рифампицин). Данная методика позволяет с первых дней назначить адекватную химиотерапию, и распределить потки поступающих больных в противотуберкулезный диспансер и направить в специализированные отделения (с лекарственно-устойчивым туберкулезом).

Рис. 5 Анализатора Xpert MTB/RIF . Подготовка образцов к проведению теста

При работе системы GeneXpert необходимы минимальное число ручных операций и специализированных знаний. Пользователь просто добавляет биологический образец для тестирования в картридж, ставит его на борт прибора, и система GeneXpert автоматически запускает цикл реакций (рис. 5). Прибор GeneXpert компактен и удобен, может быть установлен вне лаборатории. Малые размеры прибора и незначительные потребности в энергии позволяют системе работать практически в любом помещении. Настольный ПК или ноутбук используется для выполнения программного обеспечения и хранения базы данных, содержащей результаты работы системы GeneXpert. Программное обеспечение позволяет выбирать описания тестов, контролировать процесс тестирования, просматривать результаты теста и экспортировать данные для анализа в приложениях сторонних разработчиков. Программное обеспечение также используется для архивирования результатов, извлечения данных из архива и управления базой данных. Сканер штрих-кодов ускоряет ввод данных, а также снижает вероятность возникновения ошибки при вводе данных.

Дифференциация (типирование) микобактерий туберкулеза

Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от сапрофитных микобактерий, которые определяются в 0,3-3% культур.

Кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии можно выделить как из внешней среды, так и из материала здорового человека, а также и из патологического материала. Присутствие сапрофитных микобактерий в мокроте, слюне, промывных водах желудка и бронхов, моче, кале и т. д. может быть не связано с наличием заболевания и служить источником серьезных диагностических ошибок. Обнаружение кислотоустойчивых сапрофитов в мокроте больных может привести к ошибочному диагнозу туберкулеза.

Идентификация микобактерий по культуральным свойствам.При посеве на плотные питательные среды на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний (пигментообразование) можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к комплексу МБТ, либо к нетуберкулезных микобактерий (НТМБ). При культивировании МБТ на жидких питательных средах проводится тестирование на контаминацию (микроскопия культуры с окраской по Цилю-Нильсену и посев на кровяной агар) и затем молекулярно-генетическими методами подтверждается принадлежность к микобактериям туберкулезного комплекса;

Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов

Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемыми и общепринятыми тестами являются способность к росту на среде, содержащей 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; к росту на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; к росту на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Виды микобактерий туберкулезного комплекса не способны к росту на указанных питательных средах. Для дифференциации вида M.bovisот других видов туберкулезных микобактерий используют культуральный тест на способность к росту на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты. Среди всех представителей этой группы только указанный вид не дает роста на этой питательной среде.

Для контроля контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста микроорганизмов через 24-72 часа инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.

Эти исследования являются достаточно длительными, трудоемкими и требуют дополнительных капиталовложений, материально-технической базы, надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность.

Идентификация микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов

Методы видовой идентификации, основанные на выявлении генетических маркеров МБТ с помощью ПЦР, имеют преимущество в специфичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимическими методами.

Молекулярные методы дифференциации МБТ от нетуберкулезных микобактерий основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Одни методы направлены только на дифференцировку микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, другие — пригодны для точной видовой идентификации возбудителя.

К методам, дифференцирующим микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность ДНКIS6110, присутствующую только у микобактерий туберкулезного комплекса.

Иммунохроматографический методидентификации выросших культур микроорганизмов (метод поддержан ВОЗ), основанный на определении наличияспецифического антигена МБТ МРТ64, отличается простотой выполнения и позволяет получить результат идентификации МБТ за 15 минут. Данный метод может быть рекомендован в качестве основного при проведении идентификации культур, выросших на жидких и/или плотных питательных средах, а также в контаминированных культуральных образцах.

Методики, обеспечивающие точную видовую идентификацию нетуберкулезных микобактрий, более трудоемки и требуют больших материальных затрат. К ним относится гибридизационные технологии на нейлоновых мембранах (ДНК-стрипы), позволяющие идентифицировать следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M.avium ssp., M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitum, M.gordonae, M.intracellular e, M.scrofulaceum, M.interjection, M.kansasii, M.malmoense, M.peregrinum, M.marinum, M.ulcerans, M.xenopi и M.simiae, M.mucogenicum, M.goodii, M.celatum, M.smegmatis, M.genavense, M.lentiflavum, M.heckeshornense, M.szulgai, M.intermedium, M.phlei, M.haemophilum, M.kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticumvL M.shimoidei. Этим методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред и получить результат в течение 1 -2 дней.

Идентификация МБ до вида может проводиться также с помощью секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого видаМБ структур.

Определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП

Цель микробиологических методов исследования лекарственной чувствительности МБТ к ПТП состоит в том, чтобы определить отличается ли клинический изолят от «дикого» штамма МБТ по степени чувствительности к соответствующему антимикробному агенту. При оценке результата микробиологического исследования культура МБТ признаётся устойчивой, если микобактерии дают рост на питательной среде в присутствии критической концентрации заключённого в неё противотуберкулёзного препарата.

Методы определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП

Метод абсолютных концентраций на плотной

среде Левенштейна-Йенсена. Регистрация МБТ:

– по нитратредуктазной активности МБТ.

Метод пропорций на жидких питательных средах

с автоматизированным учетом роста типа

ПЦР в режиме реального времени,

бБиочиповая, стриповая, картриджная технологии

Метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена, основанный на добавлении в культуральную среду определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл. Критическая концентрация – это самая низкая концентрация, которая подавляет рост 95% «диких» штаммов МБТ. Для каждой среды или системы культивирования подобраны соответствующие критические концентрации препаратов. Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших в одной пробирке с тем или иным ПТП, не превышает 20, а посевная доза соответствует 10 7 микробных тел.

Модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов типа BACTEC MGIT 960. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ — в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат — контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке.

Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным МБТ, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960/320, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности МБТ к препарату.

На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол) и к ПТП второго ряда (канамицин, капреомицин, циклосерин, офлоксацин, этионамид, аминосалициловая кислота, амикацин).

На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, линезолид).

Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ

Генотипические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ основаны на изучении специфических участков генома МБТ и выявлении наличия или отсутствия определенных мутаций в генах, связанных с резистентностью к конкретным ПТП. При этом исследованию могут подвергаться как диагностический материал, так и выросшие культуры микроорганизмов.

Основным достоинством молекулярно-генетических является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты.

Молекулярно-генетические тест-системы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза представлены тремя основными технологиями:

Гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип. Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой среды или непосредственно в мокроте, положительной по результатам микроскопического исследования, в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда — изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы). Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, влекущих устойчивость к ПТП.

Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 % и 99 %, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду.

«Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже в системе GeneXpert).

Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость к рифампицину.

Классификация лекарственной устойчивости МБТ

Первичная лекарственная резистентность – это устойчивость МБТ к ПТП, которая обнаружена у впервые выявленных больных, которые никогда не принимали противотуберкулезную терапию.

Вторичная лекарственная устойчивость (приобретенная) – резистентность МБТ, которая обнаружена у больных, которые принимали ПТП больше 4 недель. Лекарственная устойчивость классифицируется как:

Монорезистентность – устойчивость только к одному ПТП.

Полирезистентность – устойчивость к двум и ПТП, но не к сочетанию изониазида и рифампицина.

Устойчивость к рифампицину – лекарственная устойчивость МБТ к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом тестирования лекарственной чувствительности.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – устойчивость к сочетанию изониазида и рифампицина независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.

Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – сочетанная устойчивость к изониазиду, рифампицину, фторхинолону и канамицину и/или амикацину и/или капреомицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.

Причины лекарственной устойчивости:

1) биологические – недостаточная концентрация препарата в очаге туберкулезной инфекции, индивидуальные особенности организма пациента (быстрая скорость инактивации препаратов);

2) причины, обусловленные пациентом – контакт с больными резистентным туберкулезом, отсутствие приверженности лечению (нерегулярный прием препаратов, неосознания важности лечения, преждевременное прекращение приема ПТП), неудовлетворительная переносимость препаратов, в том числе и сопутствующая патология, требующая приостановления (коррекция) противотуберкулезной терапии;

3) факторы, обусловленные течением заболевания – распространенный, быстропрогрессирующий деструктивный процесс;

4) факторы, обусловленные назначенным лечением – неадекватная схема лечения, лечение одним препаратом (монотерапия), недостаточная доза или длительность лечения, использования препаратов с перекрестной стойкостью, использование ПТП низкого качества, где доза препарата не соответствует заявленной.

источник