Большое значение в правильности выполнения лабораторных поисков МБТ имеет забор патологического материала.Посуда, в которую собирают патологический материал,должна быть стерильной. Наиболее часто исследуется мокрота. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Если такой возможности нет, материал сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4-10 о С. Если лаборатория расположена в отдалении от учреждения здравоохранения, доставку материала для исследований осуществляют 1 или 2 раза в неделю. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого.
При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении/кабине.
Мокроту на МБТ в амбулаторных условиях собирают трижды, после соответствующего туалета полости рта:
1. Первая проба – в поликлинике или стационаре, в присутствии медицинского работника, через 1-2 часа после сна.
2. Вторая проба – в тот же день через несколько часов (3-4 часа).
3. Третья проба – на следующий день пациент приносит мокроту сам.
У нетранспортабельных пациентов забор мокроты производит участковая медсестра поликлиники на дому в стерильную посуду и доставляет в бактериологическую лабораторию.
Методы этиологической диагностики туберкулеза
– с окраской по Циль-Нельсену;
– посевы на плотные питательные среды (Левен-
– посевы на жидкие питательные среды с автома-
тизированным учетом роста типа BACTEC MGIT 960/320 TB
Биочиповая, стриповая, картриджная технологии,
ПЦР в режиме реального времени
Рис. 2. Алгоритм этиологической диагностики туберкулеза
Цель этиологической диагностики туберкулеза:
• выявление эпидемиологически опасных больных туберкулезом – бактериовыделителей (с МБТ+);
• верификация диагноза туберкулеза;
• определение лечебной тактики;
• оценка эффективности лечения и прогноза;
• для эпидемического контроля за туберкулезом.
Бактериоскопический метод выявления МБТ наиболее простой, дешевый, специфический, доступный по сравнению со всеми другими методами диагностики туберкулеза. Бактериоскопический метод имеет свои разновидности: простая бактериоскопия иLEDили люминесцентной микроскопии (рис. 3).
При простой бактериоскопии мазок красят по Цилю-Нильсону: стеклянной палочкой гнойные комочки мокроты наносят равномерно на предметное стекло, и фиксируют в пламени горелки. Далее красят карболовым фуксином, который после нанесения подогревают в пламени, чтобы краситель лучше проник в МБТ, после промывания мазка обесцвечивают в 25 % растворе сернойкислоты или в 3 % соляно-кислом спирте. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3 % раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы – в голубой цвет. МБТ под микроскопом имеют вид продолговатых палочек, розового цвета на синем фоне. На окрашивание затрачивается 20-30 минут. Метод простой и дешевый, но мало информативный, чтобы обнаружить МБТ в 1 см 3 мокроты должно быть около 50-100 тыс. МБТ, если же будет меньше, то МБТ не будут найдены.
В основу метода люминесцентной микроскопии включена окраска МБТ флюорохромами (аурамин, родамин и др.), которые также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки и светятся в ультрафиолетовых лучах. LED (light emitted diode – светоизлучающие диоды) технологии позволяют конвертировать обычный световой микроскоп во флюоресцентный, увеличивая и улучшая технические возможности люминесцентной микроскопии.
При бактериологическом исследовании патологический материал культивируют на питательных средах, и выделяют культуру МБТ в чистом виде. Наиболее часто используют следующие питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финн-2. Перед посевом на питательные среды проводят обработку патологического материала для уничтожения сопутствующей флоры, разжижения, деконтаминации. В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты. Для мокроты в основном используют 10 % раствор трёхзамещённого фосфорно-кислого натрия. После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии, и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации, и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования, так как микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала (рис. 2). При использовании плотных сред инокулированные пробирки помещают в термостат при температуре 37 С на 2 суток в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 суток пробирки переводят в вертикальное положение, и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37 о С в течение 10-12 недель при регулярном еженедельном просмотре.
на среде Левенштейна-Йенсена
Рис. 3 Вид МБТ под микроскопом и в культуре
Длительность получения результатов исследований на основе классических метод выявления/культивирования микобактерий туберкулеза (в течение 1-3 месяцев) неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при наличии ЛУ у возбудителя и риском расширения спектра устойчивости МБТ.
Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов – ускоренный культуральный диагностический метод (10- 14 дней)
Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБТ примерно на 10% по сравнению с твердыми средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБТ, которые позволяют значительно ускорить получение результат. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.
Рис. 3. Автоматизированная система культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960
Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований.
В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT (mycobacteria growth indicating tube). Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка для стимуляции роста МБТ. На дне пробирки содержится кислородзависимый флюорохромный краситель. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода возникает флюоресценция. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC MGIT 960/320 (рис. 4). Один раз в час флуоресцентный сенсор считывает результаты тестирования. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU –growth units). В среднем появление роста МБТ сокращается до 11 дней. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).
Результат
незначительное или полное отсутствие свечения
Результат
на дне пробирки и оранжевое отражение в колене пробирки
Рис. 4. Результаты индикаторной пробирки MGIT на выделения культуры МБТ
Основное преимущество исследований на основе молекулярно-генетических методов в том, что они являются «быстрыми» методами, позволяющими получить результаты в относительно короткий временной период. Заключение о наличии МБТ в диагностическом материале делается на основании выявления видоспецифичного генетического маркера (ДНК) МБТ или видоспецифичных белков-антигенов, а вывод о ЛУ — на основании выявления мутаций в целевых участках генов МБТ, ассоциированных с ЛУ.
Из всех молекулярно-генетических подходов базовым методом, применяемым для выявления M.tuberculosis complex является полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Проведение ПЦР-анализа происходит в три этапа:
Детекция ДНК-продуктов амплификации
Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции (табл. 3).
Варианты проведения амплификации и визуализации результатов ПЦР
Визуализации результатов ПЦР
ПЦР с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации
ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на стрипах
ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на биологических микрочипах
ПЦР с определением специфического продукта по значению флуоресценции специфического зонда в конечной точке
ПЦР в режиме реального времени (получение результатов непосредственно во время прохождения реакции)
Выделение ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом – сложный многоэтапный процесс, который может производится вручную или с использованием автоматов для выделения.
Амплификация ДНК. Для осуществления амплификации ДНК используются так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК МБТ, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только МБТ. В большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в многочисленных штаммах МБТ имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа.
Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование – ПЦР–термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе и составляет 2 часа.
В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флюоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК МБТв забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.
Одной из инновационных технологий, основанных на ПЦРв режиме реального времени, является использование анализатора Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Этим оборудованием оснащены многие противотуберкулезные учреждения РФ. Она упрощает молекулярное тестирование, обеспечивая полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и детекция), необходимых для молекулярного тестирования. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНКM. tuberculosis. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину. Перекрестная реактивность с нетуберкулезными микобактериями отсутствует. ДНК МБТ, устойчивая к рифампицину выявляется в присутствии, как нетуберкулезных ДНК, так и в смешанных чувствительных и устойчивых штаммах. Образцы материала человека в основном могут быть взяты из мокроты, промывных вод бронхов, мочи, плеврального экссудата, ликвора. Итоговые результаты тестов предоставляются в графическом и табличном форматах (рис. 5). Xpert MTB/RIF позволяет сразу при подозрении у пациента туберкулеза взять у него мокроту и в течение двух часов определить есть ли у него МБТ и устойчивые ли они к самому эффективному противотуберкулезному препарату (рифампицин). Данная методика позволяет с первых дней назначить адекватную химиотерапию, и распределить потки поступающих больных в противотуберкулезный диспансер и направить в специализированные отделения (с лекарственно-устойчивым туберкулезом).
Рис. 5 Анализатора Xpert MTB/RIF . Подготовка образцов к проведению теста
При работе системы GeneXpert необходимы минимальное число ручных операций и специализированных знаний. Пользователь просто добавляет биологический образец для тестирования в картридж, ставит его на борт прибора, и система GeneXpert автоматически запускает цикл реакций (рис. 5). Прибор GeneXpert компактен и удобен, может быть установлен вне лаборатории. Малые размеры прибора и незначительные потребности в энергии позволяют системе работать практически в любом помещении. Настольный ПК или ноутбук используется для выполнения программного обеспечения и хранения базы данных, содержащей результаты работы системы GeneXpert. Программное обеспечение позволяет выбирать описания тестов, контролировать процесс тестирования, просматривать результаты теста и экспортировать данные для анализа в приложениях сторонних разработчиков. Программное обеспечение также используется для архивирования результатов, извлечения данных из архива и управления базой данных. Сканер штрих-кодов ускоряет ввод данных, а также снижает вероятность возникновения ошибки при вводе данных.
Дифференциация (типирование) микобактерий туберкулеза
Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от сапрофитных микобактерий, которые определяются в 0,3-3% культур.
Кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии можно выделить как из внешней среды, так и из материала здорового человека, а также и из патологического материала. Присутствие сапрофитных микобактерий в мокроте, слюне, промывных водах желудка и бронхов, моче, кале и т. д. может быть не связано с наличием заболевания и служить источником серьезных диагностических ошибок. Обнаружение кислотоустойчивых сапрофитов в мокроте больных может привести к ошибочному диагнозу туберкулеза.
Идентификация микобактерий по культуральным свойствам.При посеве на плотные питательные среды на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний (пигментообразование) можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к комплексу МБТ, либо к нетуберкулезных микобактерий (НТМБ). При культивировании МБТ на жидких питательных средах проводится тестирование на контаминацию (микроскопия культуры с окраской по Цилю-Нильсену и посев на кровяной агар) и затем молекулярно-генетическими методами подтверждается принадлежность к микобактериям туберкулезного комплекса;
Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов
Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемыми и общепринятыми тестами являются способность к росту на среде, содержащей 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; к росту на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; к росту на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Виды микобактерий туберкулезного комплекса не способны к росту на указанных питательных средах. Для дифференциации вида M.bovisот других видов туберкулезных микобактерий используют культуральный тест на способность к росту на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты. Среди всех представителей этой группы только указанный вид не дает роста на этой питательной среде.
Для контроля контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста микроорганизмов через 24-72 часа инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.
Эти исследования являются достаточно длительными, трудоемкими и требуют дополнительных капиталовложений, материально-технической базы, надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность.
Идентификация микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов
Методы видовой идентификации, основанные на выявлении генетических маркеров МБТ с помощью ПЦР, имеют преимущество в специфичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимическими методами.
Молекулярные методы дифференциации МБТ от нетуберкулезных микобактерий основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Одни методы направлены только на дифференцировку микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, другие — пригодны для точной видовой идентификации возбудителя.
К методам, дифференцирующим микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность ДНКIS6110, присутствующую только у микобактерий туберкулезного комплекса.
Иммунохроматографический методидентификации выросших культур микроорганизмов (метод поддержан ВОЗ), основанный на определении наличияспецифического антигена МБТ МРТ64, отличается простотой выполнения и позволяет получить результат идентификации МБТ за 15 минут. Данный метод может быть рекомендован в качестве основного при проведении идентификации культур, выросших на жидких и/или плотных питательных средах, а также в контаминированных культуральных образцах.
Методики, обеспечивающие точную видовую идентификацию нетуберкулезных микобактрий, более трудоемки и требуют больших материальных затрат. К ним относится гибридизационные технологии на нейлоновых мембранах (ДНК-стрипы), позволяющие идентифицировать следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M.avium ssp., M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitum, M.gordonae, M.intracellular e, M.scrofulaceum, M.interjection, M.kansasii, M.malmoense, M.peregrinum, M.marinum, M.ulcerans, M.xenopi и M.simiae, M.mucogenicum, M.goodii, M.celatum, M.smegmatis, M.genavense, M.lentiflavum, M.heckeshornense, M.szulgai, M.intermedium, M.phlei, M.haemophilum, M.kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticumvL M.shimoidei. Этим методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред и получить результат в течение 1 -2 дней.
Идентификация МБ до вида может проводиться также с помощью секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого видаМБ структур.
Определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП
Цель микробиологических методов исследования лекарственной чувствительности МБТ к ПТП состоит в том, чтобы определить отличается ли клинический изолят от «дикого» штамма МБТ по степени чувствительности к соответствующему антимикробному агенту. При оценке результата микробиологического исследования культура МБТ признаётся устойчивой, если микобактерии дают рост на питательной среде в присутствии критической концентрации заключённого в неё противотуберкулёзного препарата.
Методы определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП
Метод абсолютных концентраций на плотной
среде Левенштейна-Йенсена. Регистрация МБТ:
– по нитратредуктазной активности МБТ.
Метод пропорций на жидких питательных средах
с автоматизированным учетом роста типа
ПЦР в режиме реального времени,
бБиочиповая, стриповая, картриджная технологии
Метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена, основанный на добавлении в культуральную среду определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл. Критическая концентрация – это самая низкая концентрация, которая подавляет рост 95% «диких» штаммов МБТ. Для каждой среды или системы культивирования подобраны соответствующие критические концентрации препаратов. Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших в одной пробирке с тем или иным ПТП, не превышает 20, а посевная доза соответствует 10 7 микробных тел.
Модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов типа BACTEC MGIT 960. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ — в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат — контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке.
Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным МБТ, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960/320, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности МБТ к препарату.
На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол) и к ПТП второго ряда (канамицин, капреомицин, циклосерин, офлоксацин, этионамид, аминосалициловая кислота, амикацин).
На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, линезолид).
Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ
Генотипические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ основаны на изучении специфических участков генома МБТ и выявлении наличия или отсутствия определенных мутаций в генах, связанных с резистентностью к конкретным ПТП. При этом исследованию могут подвергаться как диагностический материал, так и выросшие культуры микроорганизмов.
Основным достоинством молекулярно-генетических является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты.
Молекулярно-генетические тест-системы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза представлены тремя основными технологиями:
Гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип. Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой среды или непосредственно в мокроте, положительной по результатам микроскопического исследования, в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда — изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы). Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, влекущих устойчивость к ПТП.
Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 % и 99 %, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду.
«Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже в системе GeneXpert).
Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость к рифампицину.
Классификация лекарственной устойчивости МБТ
Первичная лекарственная резистентность – это устойчивость МБТ к ПТП, которая обнаружена у впервые выявленных больных, которые никогда не принимали противотуберкулезную терапию.
Вторичная лекарственная устойчивость (приобретенная) – резистентность МБТ, которая обнаружена у больных, которые принимали ПТП больше 4 недель. Лекарственная устойчивость классифицируется как:
Монорезистентность – устойчивость только к одному ПТП.
Полирезистентность – устойчивость к двум и ПТП, но не к сочетанию изониазида и рифампицина.
Устойчивость к рифампицину – лекарственная устойчивость МБТ к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом тестирования лекарственной чувствительности.
Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – устойчивость к сочетанию изониазида и рифампицина независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.
Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – сочетанная устойчивость к изониазиду, рифампицину, фторхинолону и канамицину и/или амикацину и/или капреомицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.
Причины лекарственной устойчивости:
1) биологические – недостаточная концентрация препарата в очаге туберкулезной инфекции, индивидуальные особенности организма пациента (быстрая скорость инактивации препаратов);
2) причины, обусловленные пациентом – контакт с больными резистентным туберкулезом, отсутствие приверженности лечению (нерегулярный прием препаратов, неосознания важности лечения, преждевременное прекращение приема ПТП), неудовлетворительная переносимость препаратов, в том числе и сопутствующая патология, требующая приостановления (коррекция) противотуберкулезной терапии;
3) факторы, обусловленные течением заболевания – распространенный, быстропрогрессирующий деструктивный процесс;
4) факторы, обусловленные назначенным лечением – неадекватная схема лечения, лечение одним препаратом (монотерапия), недостаточная доза или длительность лечения, использования препаратов с перекрестной стойкостью, использование ПТП низкого качества, где доза препарата не соответствует заявленной.
источник
Начиная с открытия Коха, длительное время основным и наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза являлась бактериоскопия.
В настоящее время метод бактериоскопии считается недостаточным для диагностики туберкулеза. В практической работе противотуберкулезных учреждений необходимо чаще применять посев исследуемого материала на питательную среду, т. е. бактериологический метод.
Кроме бактериоскопии и метода посева, необходимо в ряде случаев использовать и прививки лабораторным животным, т. е. биологический метод.
Микобактерии туберкулеза можно обнаружить в различном материале, полученном от больного. Таким материалом является прежде всего мокрота. С усовершенствованием лабораторных методов удается обнаружить микобактерии туберкулеза в мокроте при незначительных изменениях в легких, а в ряде случаев — и без видимых на рентгенограмме туберкулезных поражений в легких. При отсутствии мокроты или невозможности ее получения исследуют промывные воды желудка. Этот способ после работ Арман-Делилля [Armand-Delill, 1927] имеет широкое применение в практике противотуберкулезных учреждений. Предполагали, что микобактерии туберкулеза попадают с мокротой в желудок как у взрослых, так и особенно у детей, страдающих легочным туберкулезом. Исследования и клинические наблюдения, проведенные в СССР и за рубежом, показали, что микобактерии туберкулеза в промывных водах желудка можно обнаружить не только при легочном, но и при внелегочном туберкулезе (кожи, костей, глаз, лимфатических узлов). Эти наблюдения доказывают возможность поступления микобактерии туберкулеза в желудок лимфогематогенным путем независимо от локализации туберкулезного процесса.
При отсутствии мокроты можно исследовать, кроме промывных вод желудка, слизь из гортани, а также промывные воды бронхов. Для этого больному натощак после предварительной анестезии дыхательных путей 1 % раствором дикаина орошают гортань подогретым изотоническим раствором хлорида натрия (10—15 мл) с помощью гортанного шприца. При этом необходимо создать такое положение больного, которое способствовало бы попаданию раствора в бронхи пораженного легкого. Изотонический раствор хлорида натрия, раздражая слизистую оболочку бронха, вызывает усиленное отделение слизи. Выделяемые при откашливании больным промывные воды бронха собирают в стерильный сосуд и подвергают дальнейшему исследованию.
Можно исследовать микобактерии туберкулеза, выделенные в фекальных массах, но при обнаружении в них микобактерий туберкулеза трудно решить вопрос, из каких органов последние выделяются.
Исследовать можно также мочу, спинномозговую жидкость, другие биологические жидкости и патологический материал.
Бактериоскопические методы выявления микобактерий туберкулеза
Бактериоскопические методы выявления микобактерий включают: обычную бактериоскопию мазков, окрашенных по Цилю — Нильсену, флотацию и люминесцентную микроскопию.
Обычная бактериоскопия. В мазках, окрашенных по Цилю — Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены только при наличии не менее 50 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (предел чувствительности метода), причем тогда, когда микобактерии не изменены тинкториально или морфологически под влиянием антибактериальных препаратов (при лечении больного).
Для приготовления мазков мокроту выливают в чашку Петри и заостренными деревянными палочками из 5—6 участков выбирают гнойные комочки на два предметных стекла для приготовления мазков. Один препарат используют для исследования на эластические волокна. На другом стекле комочки мокроты растирают третьим стеклом и получают таким образом два препарата, один из которых окрашивают по Цилю — Нильсену, а второй, например, флюорохромными красками, если имеется возможность произвести люминесцентную микроскопию.
При окраске по Цилю — Нильсену на препарат наливают карболовый фуксин, подогревают до появления паров, обесцвечивают 6% раствором серной кислоты или 3% солянокислым алкоголем и докрашивают 0,25% раствором метиленового синего.
Окрашенные мазки микроскопируют с иммерсионной системой. При этом микобактерии туберкулеза выглядят красными на синем фоне. Типичные микобактерии имеют вид тонких, прямых или слегка изогнутых зернистых палочек.
Количество микобактерий туберкулеза, обнаруживаемых методом бактериоскопии в мокроте больного, зависит от многих причин и может колебаться в различных пределах. Учитывая возможные случайности и затруднения для определения количества микобактерий туберкулеза, мокроту больного рекомендуется исследовать повторно.
С введением в практику бактериостатических средств, препятствующих росту и размножению микобактерий туберкулеза в организме больного, определение количества их в мокроте в период лечения может быть относительным критерием эффективности антибактериальной терапии, учитывать который необходимо в комплексе с клиническими, рентгенологическими и другими лабораторными исследованиями. При отрицательных результатах бактериоскопии мокроты больных туберкулезом или лиц, подозрительных на туберкулез, рекомендуется производить повторные исследования мокроты 4—5 дней подряд или гомогенизировать мокроту при помощи химических веществ, т. е. превращать в однородную массу, и центрифугировать ее с целью концентрации микобактерий туберкулеза в небольшом объеме.
В мокроте могут быть различные форменные элементы: лейкоциты, эритроциты, эпителий, альвеолярные клетки, пылевые клетки, цилиндрический мерцательный эпителий, эластические волокна, известковые соли, кристаллы холестерина. Плоский эпителий может исходить из полости рта, глотки, гортани. У лиц, вдыхающих угольную пыль и дым, в мокроте обнаруживаются пылевые клетки. Цилиндрический эпителий может включаться в мокроту при прохождении последней через бронхи и трахею. Эритроциты, единичные и неизмененные, могут попадать в мокроту из поврежденных десен и носоглотки, но наличие эритроцитов в мокроте может быть и вследствие кровохарканья.
Большое значение имеет обнаружение в мокроте эластических волокон. Эластические волокна выделяются из легких в виде петлистых пучков разной величины, сохраняющих очертания легочной альвеолы, остов стенок которой они составляют, в виде паучков разной величины, не имеющих петлистого строения («без сохранения альвеолярного строения»), или в виде небольших обрывков.
В мокроте могут быть, кроме описанных, эластические волокна Коплена — Джонса, или коралловидные. Они представляются толстыми, шероховатыми образованиями, заканчивающимися колбасообразно. Можно обнаружить и обызвествленные эластические волокна.
Наличие эластических волокон в мокроте указывает на разрушение легочной ткани. При свежем распаде пучки волокон сохраняют альвеолярное строение, при пролиферативных формах туберкулеза эластические волокна выделяются в виде пучков без сохранения альвеолярного строения. Волокна могут выделяться при всех формах туберкулеза; волокна Коппена — Джонса появляются преимущественно в случаях старого туберкулеза. Обызвествленные волокна можно видеть при распаде обызвествленных очагов во время обострения процесса.
Необходимо иметь в виду, что эластические волокна также можно обнаружить и при ряде нетуберкулезных заболеваний легких, например при абсцессе легких.
Для исследования мокроты на присутствие эластических волокон выбирают из разных мест мокроты маленькие гнойные частицы, кладут их на середину предметного стекла, не размазывая, и сейчас же покрывают покровным стеклом, чтобы они не высохли. Надавливая на середину покровного стекла тупым инструментом, мокроту распределяют тонким слоем, причем после надавливания мокрота не должна выступать за края покровного стекла. Просматривать препараты следует при малом увеличении, а изучать «подозрительные» места после установки их в центре поля зрения необходимо при большом увеличении.
В мокроте больных туберкулезом можно обнаруживать известковые соли (карбонаты и сульфаты), имеющие под микроскопом вид темных зерен разной величины. Попадают они в мокроту чаще всего из старых, распадающихся обезвествленных очагов. Известковые соли от прибавления разведенной азотной кислоты растворяются.
Кристаллы холестерина в мокроте имеют вид нежных пластинок разной величины, большей частью с обломанными краями. Эти кристаллы обнаруживаются при наличии в легких старых каверн.
Тетрада Эрлиха. С. Д. Эрлих при патологоанатомических исследованиях обнаружил в ткани легких элементы, совокупность которых он назвал «тетрадой», т. е. наличием четырех признаков, а именно: 1) обызвествленные эластические волокна; 2) кристаллы холестерина; 3) известь в виде кристаллических и аморфных образований; 4) микобактерии туберкулеза. Обнаружение в мокроте тетрады Эрлиха свидетельствует об обострении старого туберкулезного процесса в легких.
Метод флотации. Этот метод применяется в случаях скудного содержания микобактерий туберкулеза в исследуемом материале и при отрицательном результате бактериоскопии. По сравнению с обычной бактериоскопией микобактерии туберкулеза обнаруживаются методом флотации в патологическом материале примерно на 10—15% чаще. Для исследования методом флотации мокроту в количестве 12—15 мл помещают в колбу емкостью 250 мл, добавляют примерно равное количество 0,5% раствора едкого натра или кали и для лучшей гомогенизации встряхивают в течение 5—10 мин, затем до половины емкости колбы наливают дистиллированную воду с добавлением 0,5 мл ксилола или бензина. Все содержимое встряхивают 5—10 мин, после чего доливают дистиллированную воду до окончательного объема — 250 мл. Спустя 30—60 мин капельки бензина (ксилола) всплывают на поверхность, увлекая за собой микобактерии туберкулеза, концентрируя их в небольшом объеме образовавшегося на поверхности кольца. Полученное флотационное кольцо пипеткой переносят на два предметных стекла. Один препарат окрашивают по Цилю — Нильсену.
При флотации промывных вод, гноя, экссудата, спинномозговой жидкости и другого материала, не требующих гомогенизации, к ним добавляют меньшее количество раствора щелочи (от 1—2 капель до 1—2 мл в зависимости от количества материала). В дальнейшем поступают так же, как при флотации мокроты.
Люминесцентная микроскопия. Метод люминесцентной микроскопии основан на способности микобактерий туберкулеза, окрашенных флюорохромами, светиться под воздействием сине-фиолетовых лучей.
Этот метод позволяет дополнительно выявлять микобактерии туберкулеза на 17% чаще по сравнению с обычной бактериоскопией и на 8% чаще по сравнению с методом флотации. При люминесцентной микроскопии исследование производится при малом увеличении, что расширяет поле зрения и способствует обнаружению микобактерий туберкулеза, содержащихся в исследуемом материале в небольшом количестве.
Для люминесцентного исследования пользуются либо специальным микроскопом (МЛ-1 и МЛ-2), либо обычным микроскопом типа МБИ-1 с добавочным осветителем. Ко всем комплектам осветительной аппаратуры прилагаются наборы необходимых светофильтров.
Люминесцентным методом исследуют различный патологический материал. Фиксированные над пламенем препараты
окрашивают при легком подогревании в течение 15 мин специальной смесью: аурамин 00—0,5 г, радомин С — 0,05 г на 1000 мл дистиллированной воды. Затем мазок промывают водой и в течение полминуты обесцвечивают 3% солянокислым спиртом, снова промывают водой и докрашивают для гашения фона 0,25% раствором метиленового синего. При люминесцентной микроскопии микобактерии флюоресцируют золотисто-желтым цветом на темном нефлюоресцирующем фоне. Этот метод в настоящее время находит широкое применение.
Бактериологические методы
Больной туберкулезом в процессе антибактериального лечения может выделять микобактерии туберкулеза, измененные морфологически и в небольшом количестве, что не позволяет обнаружить их бактериоскопическими методами (обычная бактериоскопия, метод флотации, люминесцентная микроскопия). Поэтому в комплекс исследований, направленных на обнаружение микобактерий туберкулеза, в настоящее время обязательно включается посев патологического материала. Выделение культур микобактерий туберкулеза позволяет определить жизнеспособность возбудителя, его лекарственную чувствительность, ферментативную активность и вирулентность.
Для бактериологического исследования может быть использован любой патологический материал.
Поскольку обычно в посевном материале содержится и неспецифическая микрофлора, требуется его так обработать, чтобы уничтожить сопутствующую микрофлору и сохранить при этом жизнеспособность микобактерий туберкулеза.
В последние годы в связи с широким применением противотуберкулезных препаратов в 19—20% случаев наблюдается диссоциация между обнаружением микобактерий туберкулеза при бактериоскопическом исследовании и ростом их при посеве патологического материала. Это явление заключается в том, что видимые под микроскопом, они не растут на питательных средах. Такая диссоциация обусловлена воздействием на микобактерии туберкулеза лекарственных препаратов.
Биологическая проба. Наиболее чувствительным методом обнаружения микобактерий туберкулеза является заражение морских свинок. Однако не всегда удается получить развитие генерализованного туберкулеза в тех случаях, когда в патологическом материале содержатся микобактерии туберкулеза, устойчивые к препаратам гидразида изоникотиновой кислоты. В таких случаях микобактерии оказываются невирулентными для этих животных, и тогда при положительном результате посева патологического материала имеет место отрицательный исход заражения.
При развитии туберкулезного процесса после подкожного заражения в области введения материала к концу месяца прощупываются увеличенные лимфатические узлы. Аллергические реакции определяются при внутрикожном введении 0,1 мл ATK 1 : 10. При положительной биологической пробе у морских свинок развивается генерализованный туберкулез.
источник
Исследование мокроты на МБТ имеет важное эпидемиологическое и клиническое значение.
Мокроту лучше собирать утром. Предварительно больной должен прополоскать рот, чтобы в мокроте было меньше слюны. При малом количестве мокроты ее собирают в течение суток. При отсутствии мокроты следует вызвать ее появление раздражающими ингаляциями аэрозоля гипертонического раствора поваренной соли с содой. Исследуют также промывные воды бронхов, получаемые после введения через трахею 10—12 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия.
Исследование мокроты начинают с ее осмотра. У больных туберкулезом легких в мокроте могут быть прожилки или сгустки крови, кусочки обызвествленных камней бронхов — бронхиолитов. При микроскопическом исследовании окрашенных мазков мокроты у больных с деструкцией легочной ткани выявляются эластические волокна. Иногда встречаются так называемые коралловые волокна, которые образуются в результате отложения на эластических волокнах жирных кислот, а также покрытые известью эластические волокна и аморфные известковые частицы. Для выявления в мокроте МБТ ее исследуют неоднократно, направляя в лабораторию утреннюю порцию не менее 3 дней подряд. В ряде случаев МБТ могут быть обнаружены в мокроте и при отсутствии рентгенологических изменений в легких, в этом случае нельзя исключить язвенный туберкулез бронха. Проводить исследования мокроты необходимо до начала противотуберкулезной химиотерапии.
Выявление МБТ в патологическом материале осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим (культуральным) и биологическим методами. Кроме мокроты, объектами исследования на МБТ могут быть также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из полостей, биоптаты различных тканей.
Основным методом выявления МБТ является бактериоскопический. Во многих развивающихся странах он широко применяется не только для диагностики, но и для выявления больных туберкулезом при массовых обследованиях населения.
При прямой бактериоскопии препарат окрашивают по методу Циля—Нильсена: вначале карболовым раствором фуксина, а затем после обесцвечивания 5 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта докрашивают 0,25 % раствором метиленового синего. Окрашенные препараты микроско-пируют с иммерсионной системой. МБТ окрашиваются в красный, а окружающий фон и некислотоустойчивые микроорганизмы — в синий цвет (рис. 5).
Разрешающая способность бактериоскопического метода выявления МБТ увеличивается на 14—30 % при применении люминесцентной микроскопии. Для окраски препарата используют флюорохромы — органические красители, флюоресцирующие при освещении ультрафиолетовыми, фиолетовыми или синими лучами. Такими красителями являются аурамин 00, родамин С. Препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. МБТ светятся золотисто-желтым цветом на темном фоне (рис. 6).
Для обнаружения бактериоскопическим методом МБТ в препарате необходимо, чтобы в 1 мл мокроты содержалось не менее 100 000 микробных тел. При меньшем числе микобактерий исследование может дать ложноотрицательный результат. Для увеличения количества МБТ в единице исследуемого объема мокроты используют методы флотации и седиментации, особенно при отрицательных результатах прямой бактериоскопии.
Наибольшее распространение получил метод флотации, основанный на том, что после встряхивания водной суспензии с углеводородом МБТ всплывают вместе с образующейся пеной на поверхность. В качестве углеводорода используют бензин, бензол, ксилол. Образующееся на поверхности сливкообразное (флотационное) кольцо из частиц углеводорода с микобактериями служит материалом для приготовления препаратов. При использовании метода флотации положительные результаты бактериоскопии увеличиваются на 10 %.
Бактериологический (культуральный) метод выявления МБТ заключается в посеве мокроты на питательные среды. Перед посевом мокроту обрабатывают с целью подавления роста неспецифической мокрофлоры. Стандартной питательной средой для выращивания МБТ служит твердая яичная среда Левенштейна—Йенсена. Существуют также полужидкие и жидкие питательные среды. Рост культуры МБТ происходит за 14—90 дней.
Для выделения культуры МБТ достаточно 20—100 микробных клеток в 1 мл мокроты. Получение чистой культуры микобактерий позволяет определить их жизнеспособность, вирулентность, а также чувствительность к лекарственным препаратам.
Нередко определяемые при бактериоскопии микобактерии не растут на питательных средах вследствие утраты способности к размножению под влиянием химиопрепаратов. По данным бактериологического исследования проводится количественная оценка бактериовыделения: скудное — до 10 колоний на среде, умеренное — от 10 до 50 и обильное — более 50 колоний.
Биологический метод заключается в заражении мокротой морских свинок, которые обладают высокой чувствительностью к МБТ. Перед заражением морской свинки мокроту обрабатывают серной кислотой с целью уничтожения неспецифической микрофлоры и центрифугируют. Осадок в изотоническом растворе хлорида натрия вводят свинке подкожно в паховую область, внутрибрюшинно или в яичко. С целью снижения резистентности морской свинки к МБТ ей ежедневно вводят большие дозы кортизона. Примерно через месяц после заражения у свинки увеличиваются лимфатические узлы и развивается генерализованный туберкулез.
Среди методов выявления МБТ и диагностики туберкулеза биологический метод до последнего времени считался наиболее чувствительным, так как туберкулез у морских свинок может быть вызван при введении мокроты, содержащей менее 5 микробных тел в 1 мл. В настоящее время доказана возможность потери МБТ вирулентности. Такие микобактерии жизнеспособны, могут расти на питательных средах, но не вызывают заболевания экспериментальных животных. Поэтому для выявления в патологическом материале МБТ необходимо применять различные методы микробиологического исследования.
Исследование крови. В крови больных туберкулезом обычно наблюдаются небольшие изменения. Гипохромная анемия определяется лишь у больных с распространенным процессом и выраженной интоксикацией или при повторяющихся легочных кровотечениях. СОЭ увеличивается в периоды обострения туберкулезного процесса. Изменения числа лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови происходят главным образом при острых процессах и распаде легочной ткани. Могут наблюдаться лейкоцитоз, увеличение палочкоядерных нейтрофилов, лимфопения, моноцитоз, эозинопения.
Для оценки состояния больного, его неспецифическои и специфической реактивности, а также для определения активности туберкулезного процесса и выбора оптимальной лечебной тактики существенное значение имеет определение некоторых биохимических и иммунологических показателей.
У больных туберкулезом, выделяющих большое количество мокроты, с обильным гнойным плевральным экссудатом, амилои-дозом почек может иметь место гипопротеинемия, в отличие от больных с другими формами туберкулеза. При остром туберкулезном воспалении уменьшается альбумин-глобулиновый коэффициент, увеличивается содержание в плазме фибриногена и сиаловых кислот, появляется С-реактивный белок.
Для контроля функционального состояния печени в крови исследуют содержание аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, билирубина, определяют уровень остаточного азота, мочевины, креатинина, с сывороткой крови ставят коагуляционные пробы — тимоловую, сулемовую. С целью исключения часто сочетающегося с туберкулезом сахарного диабета в крови определяют содержание сахара.
Для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания используют иммуноферментный метод, основанный на реакции антиген—антитело. При подозрении на иммунодефицит в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов. Для диагностики иммунодефицита и контроля за его течением определяют количество В- и Т-лимфоцитов.
При активном туберкулезе все иммунологические реакции положительны, причем их выраженность зависит от фазы туберкулезного процесса. У больных с благоприятным течением туберкулеза наиболее выражена реакция бласттрансформации лимфоцитов, а с прогрессирующим — реакция торможения миграции лейкоцитов в присутствии туберкулина ППД. При вспышке процесса снижается число Т-розеткообразующих лимфоцитов и повышается число В-розеткообразующих лимфоцитов, одновременно уменьшается содержание G- и А-иммуноглобулинов.
Иммунологические тесты используют для дифференциальнои диагностики туберкулеза. Например, при раке и саркоидозе в отличие от туберкулеза отмечается подавление активности Г-лимфоцитов в реакции бласттрансформации с ФГА, у большинства больных отмечаются отрицательные реакции бласттрансформации лимфоцитов и миграции лейкоцитов с ППД.
Исследование мочи. У больных туберкулезом легких анализ мочи обычно не дает существенной диагностической информации, но иногда выявляет серьезные осложнения основного заболевания. При туберкулезе почек в моче обнаруживают белок, лейкоциты, нередко эритроциты, а также МБТ. При осложнении легочного туберкулеза амилоидозом наблюдаются стойкая протеинурия, микрогематурия. По выделению с суточной мочой 17-кетостероидов и 17-оксикортикостероидов судят о функциональном состоянии коры надпочечников.
источник