Метод посева на микобактерии туберкулеза

Основными методами выявления возбудителя туберкулеза остаются бактериоскопический, культуральный и биологический. Чувствительность каждого из этих методов известна. Если для обнаружения бактериоскопическим способом единичных микобактерий туберкулеза в препарате необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 000—500 000 особей, то для выделения культуры микобактерий достаточно 20—100 микробных клеток. Имеются данные, что при заражении животных (особенно чувствительных морских свинок) туберкулезные изменения в их органах могут быть обнаружены при содержании в 1 мл материала единичных (1—5) микобактерий.

Особенности бактериовыделения в условиях интенсификации антибактериальной терапии вызвали необходимость, с одной стороны, применять в повседневной практике способы обогащения или накопления микобактерий в единице исследуемого объекта патологического материала, с другой — усовершенствовать методы исследования.

Применение способов обогащения, а именно метода флотации и седиментации, значительно увеличило выявление возбудителя туберкулеза. Появление флюоресцентной микроскопии, введение щадящих методов обработки материала, одновременного посева патологического материала на питательные среды с разным составом также позволили увеличить результативность микробиологической диагностики туберкулеза.

Исследования, касающиеся разных апскетов бактериовыделения, показали, что у впервые выявленных больных с деструктивными изменениями в легких микобактерии туберкулеза могут определяться в 100% случаев, а у вновь выявленных больных без деструкции — в 20—40%.

Все методы обнаружения, а также идентификации микобактерий основаны на особенностях этой группы микроорганизмов. Свойства кислото-, спирто- и щелочеустойчивости используются для дифференциальных окрасок микобактерий при бактериоскопии, специфичной обработки патологического материала для посева и заражения лабораторных животных.

Чаще объектом исследования являются мокрота больных с различной легочной патологией или промывные воды бронхов. Объектами исследования могут быть как пунктаты из закрытых полостей (цереброспинальная жидкость, экссудаты и транссудаты из плевральной и брюшной полостей, гной из натечни-ков, ткань, полученная при биопсии или во время операции), которые должны быть взяты с соблюдением правил асептики, как и отделяемое открытых полостей (гной из свищей, отделяемое из ран, менструальная кровь и т. д.). Особого внимания требует сбор мочи. Для исследования используют утреннюю порцию, полученную после тщательного туалета наружных половых органов. При отрицательных результатах это исследование повторяют 2—3 раза подряд, используя суточную порцию мочи.

Бактериоскопический метод исследования остается одним из основных методов. Преимущество его заключается в быстроте получения результатов. Однако возможности его ограничены. Известно, что положительный результат при прямой бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю — Нильсену, может быть получен при значительном содержании микобактерий туберкулеза в патологическом материале. Больные, особенно в процессе антибактериальной терапии, могут выделять микобактерии в небольшом количестве. В таких случаях метод может оказаться недостаточно чувствительным для их выявления, что обусловливает применение вышеуказанных методов обогащения или накопления. Наибольшее распространение получил метод флотации, при котором микобактерии туберкулеза, содержащиеся в патологическом материале, при встряхивании водной суспензии этого материала с углеводородом, имеющим меньшую относительную плотность, чем вода, всплывают вместе с образующейся пеной. В качестве углеводорода применяют бензин, бензол, ксилол или толуол.

Для исследования 10—15 мл мокроты переливают в бутылку вместимостью 250 мл и добавляют равное количество 0,5% раствора едкого натра или едкого кали с целью гомогенизации. Через 5—10 мин тщательного встряхивания к гомогенизированной мокроте добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл любого углеводорода. После повторного встряхивания в течение 5—10 мин бутылку доливают до горлышка дистиллированной водой. Через 30 мин после добавления воды на поверхности образуется сливкообразное кольцо, состоящее из капелек углеводорода и микобактерий туберкулеза. Препараты для бактериоскопии готовят из флотационного кольца. На предметные стекла пастеровской пипеткой наносят несколько капель содержимого флотационного кольца, занимая 1/3 площади. После подсыхания мазка вновь той же пипеткой наносят капли флотационного кольца. Такое наслаивание производят 3—4 раза, предварительно высушивая предыдущую каплю. Затем высушенные мазки фиксируют в пламени горелки и окрашивают.

Метод флотации повышает обнаружение микобактерий туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией более чем на 10%. Метод седиментации в настоящее время является одним из обязательных лабораторных исследований в диагностике туберкулеза, включающих бактериоскопии^ и одновременно посев патологического материала на питательные среды.

Обработка патологического материала фосфатом натрия для посева на питательные среды является одновременно и методом накопления. Фосфат натрия — прекрасный гомогенизатор мокроты и щадящий реактив для микобактерий туберкулеза. Обработка им допускает длительную экспозицию с патологическим материалом без значительного нарушения жизнеспособности микобактерий туберкулеза. Одновременно он угнетает рост сопутствующей неспецифической флоры даже при длительном хранении материала.

К исследуемому материалу добавляют равное по объему количество 10% раствора фосфата натрия и инкубируют эту смесь при 37°С в термостате в течение 24 ч. Затем материал центри-фугирируют 5—10 мин при 2000 об/мин, сливают надосадочную жидкость, осадок засевают на питательные среды, а также делают мазок для микроскопирования.

Основным методом окраски мазков из патологического материала для выявления кислотоустойчивых микобактерий является метод Циля — Нильсена, основанный на добавлении к краске (фуксин) протравы (карболовая кислота) и подогревании в процессе окраски, дальнейшем обесцвечивании в серной кислоте или солянокислом спирте и последующем докрашивании метиленовым синим.

Распространен также метод окраски мазка по Шпенглеру. В этом случае для докрашивания применяют пикриновую кислоту, которая позволяет выявлять микобактерии в более глубоких слоях мазка. Фиксированный препарат окрашивают и обесцвечивают, как при применении метода Циля — Нильсена, и после промывания водой на 1—2 мин погружают в насыщенный раствор пикриновой кислоты.

В настоящее время в связи с интенсивной и длительной антибактериальной терапией больные могут выделять микобактерии с измененными морфологическими и тинкториальными свойствами. Это вызывает определенные затруднения как при выявлении возбудителя, так и при дифференциации его от нетуберкулезных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

В таких случаях требуются дополнительные доказательства отличия обнаруженных микобактерий от их непатогенных вариантов. Частично это удается путем более длительного, чем обычно, обесцвечивания мазков кислотой, спиртом (40—60 мин) или жавелевой водой (45—60 мин). Большинство кислотоустойчивых сапрофитов после такой обработки частично или полностью теряют первоначальную окраску. Однако для точной дифференциации микобактерий туберкулеза необходимо использовать комплекс бактериологических и биохимических методов, а в случае необходимости — биопробу.

В последнее время приобретает актуальность определение живых и мертвых микобактерий в мазках из патологического материала, что важно для оценки эффективности химиотера-певтических мероприятий. Принцип определения жизнеспособности микобактерий туберкулеза основан на различной окраске дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микробной клетки у живых и мертвых микобактерий. При этом нативная ДНК (у живых клеток) может воспринимать некоторые основные красители (например, метиленовый зеленый), деполимеризованная ДНК (у мертвых клеток) теряет способность окрашиваться этими красками, но воспринимает окраску дополнительными красителями пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Окрашенные мазки микроскопируют под иммерсией в обычном световом микроскопе. Количественные методы определения бактериовыделения приобретают большое значение для оценки тяжести процесса, выбора тактики лечения и его прогноза. В начальный период антибактериального лечения снижение массивности бактериовыделения является одним из основных показателей эффективности химиотерапии. В связи с этим в лабораторной практике применяются более точные методы количественной оценки бактериовыделения. Наиболее распространен бактериоскопический метод Гаффки — Стинкена, модифицированный Т. Н. Чайкиной, количественной оценки бактериовыделения у больных туберкулезом легких, а также количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

Наиболее результативным бактериоскопическим методом выявления микобактерий туберкулеза является люминесцентная микроскопия, которая позволяет дополнительно выявить микобактерии туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией в 14—30% случаев. Метод основан на способности микобактерий туберкулеза воспринимать окраску специальными красителями — флюорохромами, которые при облучении короткими синими или ультрафиолетовыми лучами начинают светиться. Интенсивность свечения зависит от степени абсорбции красителя, а цвет — от характера флюорохрома и физико-химического состояния бактериальной клетки.

Для окраски мазков применяют смесь аурамина 00 и родамина С (метод Хагемана в модификации Ю. Н. Зубжицкого, метод Боя в модификации И. К. Целлариуса, К. В. Шмалий) или акридиновый оранжевый (метод Адамчика). Микроскопическая картина мазка весьма контрастна, светящиеся микобактерии хорошо видны при малом увеличении объектива. Преимущества метода состоят в высокой его чувствительности, простом способе окраски и экономии времени при микроскопии.

Бактериологические (культуральные) методы выявления микобактерий туберкулеза по сравнению с бактериоскопическими отличаются большей чувствительностью. Положительные результаты можно получить при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных микроорганизмов. Это особенно важно при исследовании олнго-,бациллярного материала от впервые выявленных или мало леченных больных туберкулезом.

Основным преимуществом бактериологического метода выделения микобактерий является возможность получения чистой культуры микобактерий, которые могут быть подробно исследованы и идентифицированы; у них могут быть определены лекарственная чувствительность, вирулентность, биохимические и биологические особенности (ферментативная активность, вид микобактерий, степень жизнеспособности и др.). Однако известны трудности применения этого метода, связанные со сложностью обработки патологического материала, медленным размножением микробных клеток и соответственно появлением видимых колоний микроорганизмов. Все это снижает ценность метода для оперативного использования его результатов в клинике туберкулеза.

Для обработки патологического материала перед посевом на питательные среды используют различные вещества, которые должны обеспечить гомогенизацию материала, максимально сохранить жизнеспособность микобактерий туберкулеза, полностью подавить рост неспецифической микрофлоры, которая может находиться в исследуемом материале, быть простыми и экономичными.

Предварительную обработку патологического материала производят кислотами, щелочами, ферментами, детергентами (поверхностно-активные вещества).

В настоящее время применяют:

• 1) метод Гона — обработка растворами серной кислоты (от 2 до 6%) в зависимости от характера материала (для мочи —10%) с последующим центрифугированием и отмыванием;
• 2) метод Петрова — обработка 4% едким натром с последующим центрифугированием и нейтрализацией осадка перед посевом;
• 3) обработка 10% фосфатом натрия — наиболее широко используемый, удобный и экономичный метод.

Следует подчеркнуть перспективность применения поверхностно-активных веществ, таких как лаурилсуль-фат, лауросепт, хлоргексидинглюконикум, диоцид и др. Преимущества детергентов более четко проявляются при обработке бактериоскопически отрицательных проб мокроты. Рост микобактерий туберкулеза отмечается в 36% случаев после применения лауросепта, в 28% случаев — после применения 4% раствора едкого натра или в 20% — после применения 10% раствора натрия.

В последнее время предложен метод посева необработанного патологического материала на селективные среды (в том числе на среду 7Н10), содержащие различные антибактериальные препараты (полимиксин, амфотерицин, карбенициллин, триметоприм), задерживающие рост неспецифической микрофлоры. При этом частота загрязнения посевов уменьшается в 2—3 раза по сравнению с посевом обработанного патологического материала по стандартному методу Петрова, а также отмечается более интенсивный рост культур микобактерий туберкулеза.

Для культивирования микобактерий туберкулеза существует большое количество различных питательных сред — твердых, полужидких и жидких, последние в свою очередь можно разделить на синтетические и полусинтетические. Однако ни одна из питательных сред не обладает всеми качествами, предъявляемыми к ней современной бактериологической диагностикой. В связи с этим для увеличения результативности культурально-го метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2—3) различных питательных сред. Для выделения чистых культур чаще применяют твердые яичные среды и полужидкие яичные и агаровые среды. В качестве стандартной среды для первичного выращивания и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Всемирной организацией здравоохранения рекомендована твердая яичная среда Левенштейна — Йенсена. На этой среде хороший рост микобактерий получают на 15— 25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

Заслуживают внимания среда «Новая», предложенная Г. Г. Мордовским; среда 2, предложенная Э. Р. Финном; среды 6 и 9, предложенные В. А. Аникиным и соавт. Среда «Новая» содержит желтки куриных яиц, стимулирующие рост микобактерий, а также гликокол, наиболее полно потребляемую из среды аминокислоту [Лазовская А. Л., 1962]. Среда 2 (Финна) отличается по составу от среды Левенштейна — Йенсена отсутствием L-аспарагина, вместо которого используют глутаминат натрия. На этой среде рост микобактерий появляется на несколько дней раньше, однако процент выделения культур и» патологического материала такой же или, по данным некоторых авторов, выше.

Среды 6 и 9 (Аникина) отличаются от описанных выше питательных сред по химическому составу и физическим свойствам. Источником азотистого питания микобактерий в этих средах являются белковые ферментолизаты — препараты микробиологического синтеза, а также аммонийные соли винной и янтарной кислот. Среды обладают высокой информативностью.

Перспективны для дальнейшей разработки и усовершенствования полужидкие среды, создающие более благоприятные условия для роста микобактерий и позволяющие быстрее (череа 7—10 дней) получать положительные результаты. Среди них следует отметить среду Калфина на яичной основе и агаровые среды Миддлбрука 7Н11, 7Н12. В прозрачной среде Миддл-брука рост микроколоний учитывается визуально, в то время как при посеве на среду Калфина увеличивается затрата труда на производство мазков и микроскопирование.

Добавление к агаровой среде ТИП 5 мкг/мл селената натрия позволяет получить видимый рост колоний микобактерий туберкулеза на 3—5-й день по сравнению с 12 днями при посеве суспензии культур на среды, не содержащие селената натрия. Меньшее значение для обнаружения в патологическом материале микобактерий туберкулеза имеет посев на жидкую питательную среду (полусинтетическая среда Школьниковой, синтетическая среда Сотона, кровяная среда и т. д.). Рост микобактерий на этих средах виден невооруженным глазом на дне пробирки на 10—15-й день, а в мазке — в виде кос или скопления кучек. Недостатком этих сред является невозможность получения чистой культуры для дальнейшего исследования и большая частота приростов неспецифической флоры. Помимо глубинного посева на жидкие среды, их используют для метода микрокультивирования на стеклах по Прайсу. Этот метод также дает возможность в короткий срок (10—15 дней) получить рост микобактерий в виде микроколоний, которые после окраски по Цилю — Нильсену хорошо видны под микроскопом. Однако описанная методика довольно трудоемкая и небезопасная, поэтому не рекомендуется для использования. В настоящее время разрабатываются и применяются радиометрические методы быстрого выявления роста микобактерий при посеве патологического материала на специальные селективные среды: селективный агар Mitchison 7Н10 и селективный бульон Миддлбрука 7Н12. Последний включает в себя меченную 14С пальмитиновую кислоту. Регистрацию роста культур производят радиометрически при помощи системы ВАСТЕС. Среднее время определения роста микобактерий туберкулеза из бактериоскопически положительного материала составляет 8,3 дня, из бактериоскопически отрицательного — 13,7 дня по сравнению с 19,4 и 26,3 дня соответственно при обычных методах посева на плотные и полужидкие среды.

Таким образом, для бактериологического исследования может быть использован различный патологический материал. Способы обработки его могут быть различными в зависимости от характера материала, метода посева и применяемой питательной среды. Возможен посев патологического материала и без предварительной обработки, если он не содержит посторонней микробной флоры (цереброспинальная жидкость, серозные экссудаты и т. п.). После инкубации посева в термостате при 37 °С учитывается интенсивность роста микобактерий на твердых средах по четырехбалльной системе: +- единичные колонии (меньше 20), ++- от 20 до 50 колоний, +++- от 50 до 100 колоний, ++++- несосчитываемое количество колоний. В основном положительные результаты посевов определяются до 2 мес инкубации.

Биологический метод исследования до последнего времени считался наиболее чувствительным и эффективным способом обнаружения микобактерий туберкулеза. В настоящее время к этому методу исследования относятся более сдержанно. В связи с введением в клиническую практику интенсивной антибактериальной терапии и появлением значительного количества измененных форм возбудителя, устойчивых к лекарственным препаратам, особенно к препаратам изоникотиновой кислоты, заражение животных может дать отрицательный результат при получении роста культуры на питательных средах. Это объясняется снижением или полной потерей вирулентности лекарственноустойчивых вариантов. При исследовании олигоба-циллярного материала одновременно методом посева и биологической пробой установлен примерно одинаковый процент (6,8—7,2%) выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала. Тем не менее заражение морских свинок в ряде случаев (особенно при отрицательной бактериоскопии и посеве) остается необходимым методом диагностики туберкулеза. При этом целесообразно сочетание одновременного заражения животных и посева патологического материала.

Для увеличения чувствительности биологического исследования многие авторы рекомендуют искусственно снижать резистентность морских свинок ежедневным введением больших доз (12,5 ЕД) кортизона. Использование кортизона со дня заражения животных позволило дополнительно установить присутствие микобактерий туберкулеза в патологическом материале в 15—29% случаев. Положительного результата биопробы можно добиться, применяя последовательные пассажи. Заражая животных органами убитых, ранее зараженных животных, у которых не были обнаружены туберкулезные изменения, иногда на 3—5 пассажах удается получить видимые специфические поражения у морских свинок.

Для этой же цели применяют интратестикулярное заражение морских свинок патологическим материалом. При таком методе заражения удается обнаружить в патологическом материале маловирулентные изониазидоустойчивые микобактерии.

Биологическое исследование используют в диагностических целях для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания у нелеченых больных, для установления бактериовыделения у больных, принимавших препараты непродолжительное время. Особую ценность представляет биологическая проба при исследовании материалов от больных, страдающих урогени-тальным туберкулезом, а также для изучения свойств выделенных культур, определения их вирулентности, принадлежности к тому или иному виду.

Выделение трансформированных форм микобактерий. Широко применяемые рутинные методы не позволяют выявить указанные измененные формы возбудителя и, следовательно, в части случаев дают неадекватную информацию о состоянии процесса.

В настоящее время разработан диагностический комплекс целенаправленного выделения L-форм микобактерий. Исследованию на L-формы микобактерий может быть подвергнут любой патологический материал, который гомогенизируют (механически), затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты, центрифугируют и повторно отмывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Посев осадка производят в 3—5 пробирок с полужидкой (0,3% агар-агара) питательной средой, приготовленной на основе полусинтетической среды Школьниковой с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 20% сахарозы в качестве осмотического протектора и по 5 ЕД/мл антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) для подавления роста неспецифической микрофлоры.

Каждый посев сопровождается обязательным контрольным засевом материала в 2 пробирки с указанной выше средой, одна из которых (контроль 1) не содержит антибиотиков, другая (контроль 2) — сахарозы. Кроме того, материал засевают в 2— 3 пробирки с плотной яичной средой для исключения в исследуемом образце бактериальных форм возбудителя. Учет результатов посева и их интерпретацию производят через 1—2 мес по данным фазово-контрастной микроскопии препаратов согласно схеме выделения и учета L-форм бактерий. Применение этого комплекса показало, что при исследовании патологического материала больных различными формами туберкулеза в процессе химиотерапии L-формы микобактерий туберкулеза можно выделить в 20—100% случаев.

Дифференциация выделенных культур является одним из важнейших звеньев лабораторной диагностики туберкулеза. Она представляет большие трудности вследствие выделения у больных измененных и трансформированных микобактерий туберкулеза, микобактерий бычьего и птичьего видов, атипичных или нетуберкулезных микобактерий, в том числе и кислотоустойчивых сапрофитов. Многие из них по виду не отличаются от микобактерий туберкулеза. Для правильной оценки их патогенетической роли в заболевании человека необходима точная идентификация выделенных культур. Разработан и введен в лабораторную практику основной набор микробиологических и биохимических методов идентификации микобактерий, включающий два комплекса исследований. В первый комплекс исследований входят наиболее простые и легко воспроизводимые методики, на основании которых решается вопрос о принадлежности выделенной культуры к микобактериям туберкулеза или атипичным. При этом учитываются: скорость роста на яичных, агаровых и жидких средах; образование пигмента (в темноте и на свету); возможность роста на простых средах (мясопептонный бульон, агар, перевар Хоттингера); активность каталазы; активность перокси-дазы; термостабильность каталазы. Во второй комплекс исследований входят более сложные методы, на основании которых можно установить вид микобактерий, степень вирулентности, я также группу по Раньону, если выделены атипичные культуры. Этот комплекс включает в себя: определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам (изониазид, ПАСК и др.); определение роста на яичной среде с препаратами, ингибирующими рост микобактерий туберкулеза (салицилат натрия, паранитробензойная кислота, тибон, 5% NaCl); способность продуцировать корд-фактор при глубинном росте на жидких питательных средах; образование ни-ацина (упрощенный вариант ниацинового теста, метод Кубика и Кельбурна в модификации Бараускене); определение амидаз-ной активности (метод Бенике, метод Такэ); гидролиз твина-80 и др.

В литературе встречается описание более 100 различных тестов для дифференциации микобактерий, что указывает на несовершенство каждого из методов для целей идентификации и необходимость применения комплекса исследований.

В настоящее время бактериологические методы исследования приобретают существенное значение для определения тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания.

Определены три направления этих исследований.

1. Использование количественных методов определения бактериовыделения у соответствующих групп больных туберкулезом в процессе химиотерапии. Установление снижения или повышения количества выделяемых микобактерий туберкулеза может служить объективным показателем эффективности проводимого лечения. Для этой цели применяется модифицированный метод Гаффки-Стинкена и количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

2. Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Изменение чувствительности микобактерий отмечается ко всем противотуберкулезным средствам, однако отличается по степени, частоте и скорости появления устойчивых вариантов. Деление микобактерий на чувствительные и устойчивые производится на основании критериев, установленных клинико-лабораторными исследованиями. Мерой чувствительности, или критерием чувствительности, является минимальная концентрация препарата, задерживающая рост микобактерий при стандатных условиях постановки опыта. Эти величины при определении чувствительности микобактерий на жидких и плотных средах несколько отличаются друг от друга. Устойчивыми считают микобактерии, растущие при приведенных ниже показателях (табл. 6).

Во фтизиатрической практике приняты условные понятия первичной и вторичной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Первичной устойчивостью микобактерий считают устойчивость, которая была определена у микобактерий, выделенных от больных, не принимавших противотуберкулезных препаратов. Вторичной устойчивостью считается устойчивость микобактерий, выделенных от больных в процессе лечения противотуберкулезными препаратами. Эти понятия введены для обоснования различного подхода к лечению больных.

По данным Mitchison (1972), Rist (1972), Petersen (1983), Toldisan и соавт. (1983), первичная лекарственная устойчивость к изониазиду в развитых странах составляет около 4— 5% (1,8—5,9%) среди вновь выявленных больных туберкулезом, более тяжелая ситуация наблюдается в развивающихся странах, где первичная устойчивость к этому препарату возросла до 44%. По данным Е. Е. Кузнецовой (1972), IT. М. Рудого (1969), первичная устойчивость микобактерий в России колеблется на различных территориях в пределах 6—10,1%. Вторичная устойчивость микобактерий ко всем препаратам установлена в 40—70% случаев.

Известно, что бактериальная популяция, выделенная из патологического материала, часто содержит смесь устойчивых и чувствительных микобактерий. Кроме того, она может содержать особи с неодинаковой степенью устойчивости к одному или к нескольким лекарственным средствам, а также микобактерии с двойной резистентностью или полирезистентностью.

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза, как правило, проводят раздельно к каждому противотуберкулезному препарату. Для определения двойной устойчивости микобактерий туберкулеза был предложен метод перекрестных посевов и посевов на смеси препаратов, к которым была определена двойная устойчивость.

В настоящее время лекарственную чувствительность микобактерий определяют бактериологическими методами разведений в плотной и в жидкой питательной среде. Имеется значительное количество модификаций этих методов.

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности в жидкой среде являются метод глубинного посева микобактерий и метод микрокультивирования на стеклах (метод Прайса). Методы весьма трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, их окраски и микроскопирова-ния, требуют соблюдения большей стерильности. Однако результаты определения получают в более короткие сроки (12— 14 дней). Применение этих методов оправдано для прямого определения чувствительности микобактерий непосредственно из патологического материала. При этом в патологическом материале должно содержаться не менее 1—5 микобактерий в каждом поле зрения. Совершенствование методов определения лекарственной чувствительности направлено на уменьшение времени получения ответа лабораторного исследования. Предложен метод прямого определения чувствительности микобактерий в жидких средах при постоянном их аэрировании при инкубации в термостате. Рост микобактерий через 7—8 дней определяют нефелометрически или при микроскопии осадка после центрифугирования. Наиболее быстрое (через 4—6 дней) получение результатов лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза возможно при использовании радиометрического метода, включающего посев выделенных от больных культур на жидкую среду 7Н12, содержащую меченную 14С пальмитиновую кислоту (система ВАСТЕС).

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности на плотной среде являются метод абсолютных концентраций (метод Майснер) и метод пропорций. Эти методы менее трудоемки, позволяют использовать патологический материал, содержащий любое число микобактерий, поскольку определение может проводиться у предварительно выделенных из патологического материала микобактерий. Это обстоятельство удлиняет сроки получения результатов. Однако определение чувствительности при этом производится путем засева дозированного числа микобактерий, что позволяет более точно определить степень их чувствительности.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории. В качестве унифицированного метода рекомендуется метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна — Йенсена. Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулезного препарата, ингибирующей рост культуры микобактерий при выращивании их на среде с различным содержанием препаратов. Метод достаточно точен и наиболее прост.

3. Определение в процессе химиотерапии бактериостатиче-ской активности крови больных после приема противотуберкулезных препаратов позволяет исследовать особенности фарма-кокинетики этих препаратов и их сочетаний в организме, выражающиеся в величине их бактериостатического действия. Известно, что величина бактериостатической концентрации препаратов является одним из важных факторов, определяющих эффективность антибактериальной терапии. В свою очередь уровень бактериостатически активного препарата в крови и очагах поражения зависит от физико-химических свойств лекарства, условий его всасывания, распределения, биотрансформации и скорости элиминации. Большое значение имеет доза препарата, метод введения, а также комбинация лекарства с другими туберкулостатическими средствами. Достаточный бак-териостатический уровень препарата в крови больных можно определять несколькими путями.

• 1. Применение туберкулостатической пробы позволяет определить достаточность концентрации изо-ниазида в крови больных для подавления роста микобактерий, предварительно выделенных от этих больных.
• 2. Определение концентрации антибактериальных препаратов в крови больных микробиологическим методом серийных разведений или химическим методом и сравнение этих показателей с лекарственной резистентностью выделенных микобактерий туберкулеза может подсказать клиницистам более правильную тактику дальнейшего лечения больного.
• 3. Определение бактериостатической активности крови больных после приема отдельных препаратов и их комбинаций методом серийных разведений с использованием стандартного тест-штамма «Академия», обладающего чувствительностью ко всем препаратам, лежащей в пределах чувствительности диких штаммов микобактерий, позволяет сравнить активность как отдельных препаратов, так и различных комбинаций и выбрать наиболее целесообразные сочетания. Эти исследования рационально проводить для выяснения причин неэффективности антибактериальной терапии и выбора пути и средств направленной ее коррекции.

источник

МИКОБАКТЕРИИ Род Mycobacteriurn (сем. Mycobacteriaceae, порядок Actinomycetales) включает более 100 видов, широко распространенных в природе. Большая часть – сапрофиты и условно-патогенные. У человека вызывают туберкулез (М.tuberculosis – в 92% случаев, М.bovis — 5%, М.africanus – в 3%) и лепру (М.lерrае).

М.tuberculosis – туберкулез – хроническое инфекционное заболевание. В зависимости от локализации выделяют туберкулез органов дыхания и внелегочные формы (кожи, костей и суставов, почек и др.). Локализация зависит от путей проникновения и вида возбудителя.

Морфология. Гр+, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 2–8 и шириной 0,3 мкм. Высокое содержание липидов придает ряд характерных свойств: устойчивость к кислотам, щелочам и спирту, трудное восприятие анилиновых красителей (для окраски применяют метод Циля–Нильсена). В культурах встречаются зернистые формы, ветвящиеся, зерна Муха (шаровидные кислотоподатливые, легко окрашивающиеся по Грамму). Возможен переход в L-формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют.

Для размножения используют сложные пит среды, содержащие яйца, глицерин, картофель. Стимулируют рост микобактерий АСП, соли NН₄, альбумин, глюкоза, твин-80. Чаще всего применяют среду Левенштейна–Йенсена (яичная среда с добавлением картофельной муки, глицерина и соли) и среду, содержащую АСП, глицерин, цитрат Fe, фосфат калия. Размножаются медленно. Период генерации длителен – деление клеток в оптимальных условиях 1 раз в 14–15ч. Первые признаки роста обнаруживаются через 8–10 дней после посева. Затем на плотных средах появляются морщинистые, сухие с неровными краями колонии. В жидких средах – сначала нежная пленка на поверхности, затем утолщается и падает на дно. Среда при этом остается прозрачной.

АГ. Выделяют белковые, полисахаридные и липидные соединения. АТ образуются на туберкулиновые протеиды, на полисахариды, фосфатиды, корд-фактор. Специфичность АТ определяется в РСК, РНГА, преципитации в геле. АГ состав М.tuberculosis, М.bovis, M.leprae и других микобактерий (включая многие сапрофитические виды) сходен. Туберкулиновый протеин (туберкулин) обладает выраженными аллергенными свойствами.

Экология и распространение. В естественных условиях М tuberculosis вызывает туберкулез у человека, человекообразных обезьян. Из лабораторных животных высокочувствительными являются морские свинки, менее – кролики. К М.bovis – возбудитель туберкулеза у крупного рогатого скота, свиней и человека – высокочувствительны кролики и менее – морские свинки. М.africanus вызывает туберкулез в странах Африки. Путь заражения воздушно-капельный, возбудитель проникает через верхние дыхательные пути, иногда через слизистые оболочки ЖКТ или через поврежденную кожу.

В окружающей среде длительное время сохраняются (в высохшей мокроте – в течение нескольких недель, в воде – более года).

К действию дезинфицирующих веществ более устойчивы, чем другие бактерии Þ требуются более высокие концентрации и более длительное время воздействия. При кипячении погибают мгновенно, чувствительны к УФ.

Патогенез. Источник заражения – люди и животные с активно протекающим туберкулезом, с наличием воспалительных и деструктивных изменений, выделяющие микобактерии. В зоне проникновения и размножения возникает воспалительный очаг (первичный эффект – инфекционная гранулема), наблюдаются сенсибилизация и специфический воспалительный процесс в регионарных лимфоузлах – формируется первичный туберкулезный комплекс. При доброкачественном течении болезни первичный очаг может рассасываться, пораженный участок кальцинироваться и рубцеваться. Но этот процесс не завершается полным освобождением от возбудителя. В лимфоузлах и других органах туберкулезные бактерии сохраняются много лет, иногда в течение всей жизни. Такие люди, с одной стороны, обладают иммунитетом, а с другой – остаются инфицированными.

При сниженной сопротивляемости организма первичный туберкулезный процесс генерализуется. Диссеминация приводит к образованию в различных органах туберкулезных очагов. Характерна интоксикация. При генерализации – поражение органов мочеполовой системы, костей и суставов, мозговых оболочек, глаз.

Не синтезируют экзотоксин. Поражение тканей вызывает ряд веществ – липиды, мураминдипептид, фтионовые кислоты, сульфатиды, туберкулин, возникают специфические гранулемы и поражение тканей. Токсическое действие оказывает гликолипид, так называемый корд-фактор, разрушает митохондрии клеток, нарушает функцию дыхания.

Патогенетически важным является действие на организм инфицированного человека туберкулина. Очищенный от примесей туберкулин (PPD – очищенный протеиновый дериват) является белком. Внутрикожное введение туберкулина вызывает у инфицированных людей местную воспалительную реакцию в виде инфильтрата и покраснения (реакция Манту). Неинфицированные люди реакции на туберкулин не дают. Эту пробу применяют для выявления инфицированных, сенсибилизированных людей.

Иммунитет. Заражение не всегда приводит к развитию заболевания, это зависит от состояния микроорганизмов. Восприимчивость усиливается в неблагоприятных условиях (изнурительный труд, недостаточное и неполноценное питание, плохие жилищные условия и т.д.). Способствуют развитию туберкулезного процесса и эндогенные факторы – сахарный диабет; психические болезни и др. Значение АТ в формировании сопротивляемости к туберкулезной инфекции до сих пор неясно. Считается, что АТ являются «свидетелями» иммунитета и не оказывают ингибирующего действия на возбудитель.

Большое значение имеет клеточный иммунитет. По РБТЛ, цитотоксическому действию лимфоцитов на клетки-«мишени», содержащие АГ микобактерии, выраженности РТММ судят о течении заболевания. Т-лимфоциты после контакта с АГ синтезируют медиаторы, усиливающие фагоцитарную активность макрофагов. При подавлении функции Т-лимфоцитов туберкулезный процесс становится быстротечным и тяжелым.

Микобактерии туберкулеза разрушаются внутриклеточно в макрофагах. Фагоцитоз является одним из механизмов, приводящих к освобождению организма от микобактерии туберкулеза, но он часто незавершенный.

Другой важный механизм – фиксация микобактерий в очагах благодаря образованию инфекционных гранулем при участии Т-лимфоцитов, макрофагов и других клеток. В этом проявляется защитная роль ГЗТ.

Иммунитет при туберкулезе раньше называли нестерильным. Значение имеет не только сохранение живых бактерий, поддерживающих повышенную сопротивляемость к суперинфекции, но и явление «иммунологической памяти». При туберкулезе развивается реакция ГЗТ.

Лабораторная диагностика. Материалом для микробиологического исследования в зависимости от локализации процесса служат мокрота, гной, моча, спинномозговая жидкость, испражнения.

Бактериоскопическое исследование. Мокроту выливают в чашку Петри, ставят на черную поверхность стола, выбирают гнойные комочки, наносят их на предметное стекло и растирают между двумя стеклами. Спинномозговую жидкость для образования пленки фибрина и фиксации в ней микобактерии туберкулеза оставляют на сутки в холодном месте. Затем ее осторожно распределяют на предметном стекле. Мочу центрифугируют для получения осадка. Сделанные мазки окрашивают по Цилю–Нельсену. Микобактерии туберкулеза окрашиваются в ярко–красный (рубиновый) цвет. Если в материале находится небольшое количество микобактерии и в обычных мазках их нельзя обнаружить, применяют методы обогащения.

Метод гомогенизации. Суточную порцию мокроты выливают во флакон или банку, добавляют равный объем 1% водного раствора натрия гидроксида, плотно закрывают резиновой пробкой и энергично встряхивают до, полной гомогенизации (10–15 мин). Утратившую вязкость мокроту центрифугируют, жидкость сливают, осадок нейтрализуют добавлением 2–3 капель 10% соляной кислоты. Из осадка готовят мазки и окрашивают по Цилю–Нельсену.

Метод флотации. Подвергнутую щелочной гомогенизации мокроту для более полного растворения оставшихся слизистых комков помещают на 30 мин на водяную баню при температуре 55°С. Затем к ней добавляют 1–2 мл ксилола (бензола, бензина) и встряхивают в течение 10 мин, потом отстаивают 20 мин при комнатной температуре. Капельки ксилола с адсорбированными микобактериями всплывают, образуя сливкообразный слой, его снимают пипеткой и несколько раз наносят по мере высыхания на предметное стекло. Сделанные мазки тоже окрашивают по Цилю–Нельсену.

Бактериологический метод. Выделить культуру микобактерии туберкулеза удается при наличии в 1 мл исследуемого материала даже 20–100 микробных тел. При этом определяют ее устойчивость к лекарственным препаратам, для того чтобы разработать индивидуальную схему лечения больных.

Выделяя из мокроты культуру микобактерии туберкулеза, к ней в целях уничтожения кислотоподатливой микрофлоры добавляют двойной объем 6% серной кислоты, встряхивают в течение 10 мин, центрифугируют. Затем жидкость сливают, осадок нейтрализуют 1–2 каплями 3% натрия гидроксида или несколько раз отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Нейтрализованные осадки мокроты засевают на скошенную в пробирках яичную среду Левенштейна–Йенсена с малахитовым зеленым, который угнетает рост банальной микрофлоры.

Спинномозговая жидкость, экссудат, гной, кровь кислотно–щелочной обработке не подвергаются, их засевают на среду Левенштейна–Йенсена пипеткой с последующим втиранием бактериальной петлей. Ватные пробки, которыми закрывают засеянные пробирки, заливают парафином, чтобы избежать высыхания среды. Посевы помещают в термостат при температуре 37°С и выдерживают в течение 6–8 недель.

Биологический метод. Животных, чаще морских свинок, заражают для выделения чистых культур микобактерии туберкулеза и изучения патогенеза заболевания. Поскольку большинство изониазидустойчивых штаммов утратило к ним вирулентность, биологический эксперимент в настоящее время не находит широкого применения.

Аллергическая реакция Манту. Выполняют ее путем внутрикожного введения 0,1 мл альт–туберкулина в ладонную поверхность предплечья. Ее результат учитывают через 24–48 ч. В положительных случаях на месте введения туберкулина появляется инфильтрат с венчиком гиперемии диаметром 10 мм, который чаще всего свидетельствует об инфицированности туберкулезом, а у 2–3–летних детей может также являться диагностическим тестом активно развивающейся болезни.

Профилактика и лечение. Для специфической профилактики – живая вакцина БЦЖ-BCG (Bacille Calmette–Guerin). Штамм БЦЖ был получен при длительном пересеивании палочек на картофельно-глицериновой среде с добавлением желчи. За 13 лет была получена культура со сниженной вирулентностью. В нашей стране в настоящее время вакцинируют всех новорожденных на 5–7-й день жизни внутрикожно. Ревакцинация – лицам с отрицательной туберкулиновой пробой с интервалом в 5–7 лет до 30-летнего возраста. Создают т.о. инфекционный иммунитет, при котором возникает реакция ГЗТ. Для лечения – АБ, химиотерапевтические препараты I ряда: тубазид, фтивазид, изониазид, дигидрострептомицин, ПАСК и II ряда: этионамид, циклосерин, канамицин, рифампицин, виомицин. Также проводится десенсибилизирующая терапия и стимуляция естественных защитных механизмов организма.

источник

Туберкулез – это микробная, специфическая и хронически протекающая инфекция.

Вопреки распространенному мнению, что туберкулез поражает только легкие, он опасен для всех тканей тела, за исключением волос и ногтей. Но легочные формы инфекции наиболее распространены, поэтому для диагностики этой формы применяют посевы мокроты.

Но это не единственная методика определения болезни. Нередко туберкулез протекает скрыто, его принимают за ОРВИ, бронхиты, пневмонии и другие проблемы здоровья, важно вовремя его определить, так как лечение длительное, сложное и многоэтапное, подавить бактерии непросто.

Чтобы определить наличие патогенных бактерий в организме больного, можно использовать несколько методов исследования. К ним относят микроскопию мокроты (метод Циля-Нильсена), люминисцентное исследование, посев мокроты (или бактериоскопия) и метод ПЦР-реакции.

Все эти тесты обнаруживают наличие микобактерий туберкулеза в образцах мокроты, собранной по всем правилам и немедленно доставленной в лабораторию.

Чтобы результаты были достоверными, берется не одна, а три пробы мокроты, из каждой берется необходимый объем материала для исследования.

Результаты считают положительными, если хотя бы в одной из трех проб обнаруживаются микобактерии туберкулеза – кислотоустойчивые микробы. Для всех этих исследований берут мокроту, которую получают при откашливании или за счет отсасывания из бронхов или бронхоскопии.

Данный метод на сегодняшний день, наряду со всеми другими, относится к ведущему методу диагностики туберкулеза. Он помогает визуально определить микобактерии, и сделать выводы о том – есть он в образцах или нет. Этот метод, хотя он простой и примитивный, не уступает многим другим более сложным и дорогим методикам в точности. Исследование проводится после получения образца мокроты при откашливании:

• Мазок окрашивается специальными красителями;
• Просматриваются на предметном стекле под микроскопом, используя иммерсионную систему.
• В приготовленном мазке микобактерии, устойчивые к кислоте, приобретают красное окрашивание.
• Результаты определяются на протяжении часа, но иногда для подготовки и исследования нужно около суток.

Методика доступная и простая, экономичная и может применяться в любой клинике. Однако, нет строгой специфичности исследования, она выявляет любые микобактерии, даже те, что не приводят к воспалению легких и поражениям.

Для этого исследования мокрота готовится так же, как для обычной микроскопии, но используется особый микроскоп, который выявляет свечение микобактерий желтым цветом, когда весь фон при этом окрашен в синий цвет. При помощи этой методики определяется еще и количество возбудителей, и по нему можно говорить о тяжести состояния и длительности туберкулеза.

Это современный высокоинформативный метод выявления бактерий. Он определяет ДНК микобактерий, которая специфична для каждого типа возбудителей. В лаборатории воспроизводят копирование участка ДНК бактерий, что позволяет определить его затем за счет определенных реактивов и методов идентификации. Метод точно выявляет туберкулез.

Это один из стандартов исследования на туберкулез, он проводится всем пациентам после забора материала. Посевы проводят на специальные питательные среды, и достаточно даже небольшого количества живых туберкулезных палочек для их идентификации. Рост бактерий длительный, посевы готовят долго, могут быть сроки от 3 до 12 недель.

Колонии туберкулезных бактерий имеют специфичный вид, по которому их можно распознать. При помощи данной методики можно определить еще и бактериовыделение (когда пациент особенно опасен).

Оценка результатов проводится в баллах. Нормативом будет отрицательный посев, не обнаруживающий роста бактерий. Положительные результаты трактуют как:

• 1 балл – скудная картина туберкулезной инфекции;
• 2 балла – умеренное выделение бактерий;
• 3 балла – обильное бактериовыделение.

При результате 3 балла пациент опасен для окружающих, у него туберкулез имеет активное течение, микробы вредят его здоровью.

Также в результате исследования определяют еще и чувствительность посеянных бактерий к антибиотикам и химиотерапевтическим препаратами. После выращивания колоний на питательных средах проводят тест на препараты и по его результатам вносят коррективы в лечение.

Мокрота выделяется легкими при различных патологиях, в том числе и при туберкулезе. Она может иметь различный характер – слизистая, кровянистая, гнойная. Отделение мокроты происходит при кашле, поэтому можно собрать ее как при откашливании, так и за счет аспирации из бронхов. Чтобы результаты были максимально достоверными, важна правильная методика забора материала:

• Мокрота сдается утром после сна, строго натощак;
• Перед сдачей анализа не нужно чистить зубы;
• Важно заранее прополоскать полость рта теплой водой;
• Мокроту стимулируют к отделению за счет серии из трех глубоких вдохов;
• За счет кашлевых толчков откашливается комочек мокроты, который собирается в стерильную емкость, которую сразу же закрывают и доставляют в лабораторию. При сборе мокроты краев емкости не касаются, это может привести к искаженным результатам.

Особенностями сбора именно на туберкулез являются некоторые дополнительные пункты в сборе. Так, процедуру проводят в отдельном помещении, где активно вентилируются комнаты, либо есть открытое окно, в отсутствии посторонних или членов семьи, чтобы не распространять бактерии. Затем комната, где был больной и собирал мокроту, тщательно проветривается.

Материал собирают трижды, каждое утро, используя новый контейнер. Если мокрота плохо откашливается, проводят ингаляцию с физраствором для стимуляции и откашливания.

Хотя сегодня туберкулез можно выявлять различными методами – флюорография, пробы Манту и Диаскинтест, для подтверждения инфекции необходимо обнаружение бактерий. Учитывая, что данные посева оценивают в совокупности с ПЦР, бактерископией, это дает максимально точный результат. Помимо этого, определяется еще и наличие бактериовыделения – то есть заразной стадии инфекции. Помимо прочего, посевы дают возможности определить необходимые лекарства, к которым чувствительны бактерии, что помогает в лечении туберкулеза. При закрытой форме туберкулеза мокрота не будет обнаруживать наличие бактерий.

Парецкая Алена, врач, медицинский обозреватель

2,736 просмотров всего, 1 просмотров сегодня

источник