Метод прайса в диагностике туберкулеза

Метод Школьниковой. Нестерильный патологический материал обрабатывают 5—8—10—12% раствором серной кислоты около 20 минут (включая процесс центрифугирования), как описано выше. Осадок дважды при центрифугировании промывают дестиллированной водой (избыток кислоты задерживает рост микобактерии туберкулеза на кровяной среде). Промытый осадок засевают петлей в 3 пробирки с гемолизированной кровью. Гемолизированная кровь готовится следующим образом: 1 часть цитратной крови кролика или барана гемолизируют добавлением 3 частей дестиллированной воды, после чего ее разливают по 5 мл в пробирки. Можно пользоваться донорской кровью, не содержащей консерванта.

Центрифужные осадки материалов, свободных от посторонней микрофлоры (экссудат, асцитическая и спинномозговая жидкость и т. п.), можно засевать в кровяную среду без предварительной обработки кислотой.

Посевы (по одной пробирке) исследуют на наличие роста на 7-й, 10-й или 20-й день, причем среда с посевом центрифугируется, осадок промывается дестиллированной водой при центрифугировании для удаления кровяного пигмента, затрудняющего окраску и микроскопирование препаратов, из промытого осадка делаются окрашенные по Циль-Нильсену мазки. Этот метод более чувствителен по сравнению с обычными посевами на яичные среды и, кроме того, заметно ускоряет получение результатов.

Метод Прайса. Изготовляют мазки из патологического материала на нескольких хорошо обезжиренных и простерилизованных обжиганием предметных стеклах. Готовые мазки сначала погружают на 5 минут в 6% раствор серной кислоты, а затем промывают погружением в стерильный физиологический раствор. Промытые препараты вносят в жидкую питательную среду (1 часть цитратной крови + 3 части дестиллированной воды). Через 7—10 дней на мазках появляется рост в виде микроколоний, которые хорошо видны под микроскопом на мазках, окрашенных по Циль-Нильсену.

источник

Для диагностики туберкулёза применяют бактериоскопические, бактериологические, биологические, серологические и аллергологические методы, входящие в обязательный диагностический минимум. Материалом для исследований служат мокрота, отделяемое свищей, моча, СМЖ, испражнения.

Микроскопия возбудителя туберкулеза в патологическом материале. В мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, обнаруживают кислотоустойчивые палочки возбудителя туберкулеза.

Нередко материал содержит мало бактерий туберкулеза и для повышения вероятности их обнаружения используют методы обогащения: центрифугирование и флотацию. В первом случае исследуемый материал обрабатывают смесью растворов NaCl и NaOH, центрифугируют и микроскопируют осадок. Второй метод включает обработку материала смесью NaOH, дистиллированной воды и ксилола (или бензола). Образец энергично встряхивают; образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерии. Пену отсасывают и готовят мазки.

Наиболее результативна люминесцентная микросколия возбудителя туберкулеза. Материал обрабатывают аурамин-родамином и бактерии окрашиваются в бело-жёлтый цвет. Для выявления L-форм применяют AT, меченные флюорохромами.

Достоинство метода — возможность получения чистой культуры туберкулеза, позволяющая её идентифицировать, оценить вирулентные свойства и определить чувствительность к ЛС. Материал засевают, тщательно втирая, на твёрдые питательные среды.

Для повышения эффективности выделения возбудителя туберкулеза и уничтожения контаминирующей микрофлоры применяют методы обогащения или обрабатывают материал 6-12% серной кислотой. Основной недостаток бактериологического метода — длительность получения результата (от 2 до 12 нед). В связи с этим разработаны ускоренные микрометоды выделения возбудителя туберкулеза.

Один из распространённых методов выделения возбудителя туберкулеза, метод Прайса, заключается в следующем. Материал помещают на предметное стекло, обрабатывают серной кислотой, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной лизированной кровью.

Стекло вынимают через 3-4 сут и окрашивают но Цилю-Нильсену. При микроскопии обнаруживают микроколонии микобактерии возбудителя туберкулеза. Вирулентные бактерии образуют змеевидные (рис. 22-2), а невирулентные — аморфные микроколонии. Культуры L-форм выделяют посевом в столбик полужидкой среды и инкубируют при 37 °С 1-2 мес.

Рост проявляется в виде облачка помутнения с мелкими вкраплениями. Вирулентность выделенной культуры возбудителя туберкулеза определяют заражением лабораторных животных и по наличию корд-фактора. Последний легко идентифицируют по способности микобактерии связывать нейтральный красный и нильский голубой и удерживать их после добавления щелочи. Вирулентные штаммы возбудителя туберкулеза удерживают красители, авирулентные — нет.

источник

Лабораторная диагностика. Для диагностики туберкулеза применяют все методы: бактериоскопический, бактериологический, серологический, биологический, аллергические пробы, ПЦР. При бактериоскопическом исследовании исходного материала (мокрота, моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения) необходимо учитывать, что содержание в нем микобактерий может быть незначительным, выделение их эпизодическим и в нем могут быть измененные варианты возбудителя, в том числе L-формы. Поэтому для повышения вероятности обнаружения микобактерий туберкулеза используют методы концентрирования их с помощью центрифугирования или флотации, а также фазово-контрастной (для обнаружения L-форм) и люминесцентной микроскопии (в качестве флуорохромов используют аурамин, аурамин-родамин, акридиновый оранжевый и др.).

Биологический метод — заражение морских свинок — является одним из наиболее чувствительных. Считается, что заражающая доза возбудителя для них составляет несколько клеток. Морские свинки могут быть использованы и для обнаружения L-форм туберкулезных бактерий, но в этом случае необходимо сделать несколько последовательных заражений, так как L-формы обладают меньшей вирулентностью и вызывают у свинок доброкачественную форму туберкулеза, которая в случае реверсии L-форм в исходное состояние может перейти в генерализованный процесс.

Из числа серологических реакций для диагностики туберкулеза предложены РСК, РПГА, реакции преципитации, методы иммуноферментного анализа (в том числе точечного), радиоиммунный метод, иммуноблотинг, реакция агрегат-гемаг- глютинации (для обнаружения ЦИК) и др. Использование различных антигенов позволяет обнаруживать наличие определенных антител. Для совершенствования серологических методов диагностики туберкулеза важное значение имеет получение моноклональных антител к различным антигенам микобактерий. Это позволит выявить те специфические эпитопы туберкулезных бактерий и соответственно те антитела к ним, обнаружение которых имеет наибольшее диагностическое значение, а также позволит создать коммерческие тест-системы для иммунодиагностики туберкулеза.

Среди всех методов микробиологической диагностики туберкулеза решающим все же остается бактериологический. Он необходим не только для постановки диагноза болезни, но и для контроля эффективности химиотерапии, своевременной оценки чувствительности микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам, диагноза рецидивов туберкулеза, степени очищения больного организма от возбудителя и выявления его измененных вариантов, особенно L-форм. Исследуемый материал перед посевом необходимо обрабатывать слабым раствором серной кислоты (6— 12 %) для устранения сопутствующей микрофлоры. Выделение чистых культур микобактерий ведут с учетом скорости их роста, пигментообразования и синтеза ниа- цина. Дифференциацию между отдельными видами микобактерий осуществляют на основании их биологических свойств, как указано выше. Вопрос о вирулентности микобактерий решается с помощью биологических проб и на основании обнаружения корд-фактора. Для этой цели предложены цитохимические реакции. Они основаны на том, что вирулентные микобактерии (содержащие корд-фактор) прочно связывают красители — нейтральный красный или нильский голубой — и при добавлении щелочи сохраняют цвет краски, а раствор и невирулентные микобактерии изменяют свою окраску.

Для более быстрого выделения возбудителя туберкулеза предложен метод микрокультур. Суть его состоит в том, что на предметное стекло наносят исследуемый материал, обрабатывают его серной кислотой, отмывают, стекло помещают в цит- ратную лизированную кровь и инкубируют при температуре 37 «С. Уже через 3— 4 сут. рост микобактерий на стекле проявляется в виде микроколоний, которые к 7—10-му дню достигают максимального развития, а микобактерии хорошо выявляются при микроскопии. При этом вирулентные микобактерии образуют змеевидные колонии, а невирулентные растут в виде аморфных скоплений.

Для обнаружения L-форм используют культуральный, биологический и иммунофлуоресцентный методы. В связи с широким распространением лекарствен- ноустойчивых штаммов микобактерий возникла необходимость усилить контроль за этим процессом. С этой целью, а также для более точной идентификации и дифференциации микобактерий используют молекулярно-генетические методы, в частности, метод типирования штаммов, основанный на выявлении различий в структуре генома микобактерий — геномная дактилоскопия. Метод заключается в обнаружении в геноме микобактерии ряда повторяющихся нуклеотидных последовательностей и анализе полиморфизма длин фрагментов рестрикции. В качестве зонда (праймера) обычно используют IS6110 (англ. insertion sequence — вставочная последовательность). В хромосоме микобактерии, как правило, имеется несколько копий элемента IS6110, которые отличаются высокой стабильностью своего местоположения, что позволяет точно идентифицировать различные штаммы.

Биологический способ обнаружения L-форм заключается в серии последовательных пассажей на морских свинках.

Для иммунофлуоресцентного метода используют диагностические сыворотки, содержащие меченные флуорохромом антитела к антигенам L-форм.

9. Бактериологическая диагностика туберкулеза. Схема дифференцирования микобактерий в ходе их выделения. Специфическая профилактика туберкулёза. Вакцина БЦЖ, состав, способы применения. Химиотерапия туберкулеза.

По патогенным свойствам род Mycobacterium подразделяют на две группы:

1) патогенные и условно-патогенные (потенциально патогенные)

2) сапрофита. Для их ускоренной предварительной дифференциации учитывают прежде всего три признака: а) скорость и условия роста; б) способность к пигментообразованию; в) способность синтезировать никотиновую кислоту (ниацин).

По скорости роста род Mycobacterium подразделяют на три группы:

1) Быстрорастущие — крупные видимые колонии появляются ранее 7-го дня инкубации (18 видов).

2) Медленнорастущие — крупные видимые колонии появляются после 7-ми и более дней инкубации (20 видов).

3) Микобактерии, которые требуют специальных условий для роста или не растут на искусственных питательных средах. К этой группе относятся два вида: М. leprae и М. lepraemurium.

По способности к пигментообразованию микобактерии также делят на 3 группы:

1) Фотохромогенные — образуют пигмент лимонно-желтого цвета при росте на свету.

2) Скотохромогенные — образуют пигмент оранжево-желтого цвета при инкубировании в темноте.

3) Нефотохромогенные — пигмента не образуют (независимо от наличия света), иногда культуры имеют светло-желтоватую окраску.

К патогенным и потенциально патогенным относится 24 вида.

Профилактика. Помимо проведения широких социально-экономических мероприятий, направленных на улучшение жизни населения, раннего и своевременного выявления больных туберкулезом и оказания им эффективной лечебной помощи, большое значение имеет плановая массовая вакцинация против туберкулеза. Она осуществляется вакциной БЦЖ, полученной А. Кальметтом и Ш. Гереном из ослабленного многолетними пересевами штамма М. bovis. Вакцинации подлежат все новорожденные дети на 5—7-й день жизни. Вакцину, содержащую 0,05 мг сухих живых бактерий в объеме ОД мл, вводят внутрикожно. Ревакцинацию проводят в возрасте 7—12—17—22 и 27—30 лет только лицам, отрицательно реагирующим на внутри- кожную пробу Манту (5 ТЕ/0,1 мл).

Лечение. Консервативное лечение туберкулеза проводят с помощью антибиотиков и химиопрепаратов. Препараты I ряда (более ранние) включают производные парааминосалициловой кислоты (ПАСК), гидразида изоникотиновой кислоты (ГИНК) — изотиазид (тубазид), фтивазид и др. и препараты группы стрептомицина. Препараты II ряда — циклосерин, канамицин, флоримицин, рифампицин и другие антибиотики. У микобактерий к химиопрепаратам, в особенности I ряда, часто наблюдается устойчивость, поэтому лечение должно сопровождаться контролем степени чувствительности их к применяемым препаратам.

10. Возбудитель лепры. Морфологические и культуральные особенности. Лабораторная диагностика. Аллергические пробы и их диагностическое значение. Химиотерапия лепры.

Лепра — высококонтагиозное и одновременно низкопатогенное хроническое заболевание, при котором субклиническая инфекция — обычное явление, в то время как клинические проявления отмечаются только у небольшого числа инфицированных лиц. Характеризуется длительным течением, специфическим поражением кожи, слизистых оболочек, периферических нервов и различных внутренних органов. Возбудитель — Mycobacterium leprae — был открыт в 1874 г. А. Хансеном. До сих пор никому не удавалось получить рост возбудителя проказы на искусственных питательных средах. Палочка лепры является строгим внутриклеточным паразитом тканевых макрофагов (гистиоцитов), моно- нуклеарных фагоцитов и других клеток. Ее удается культивировать только в организме мышей, крыс и особенно при внутривенном заражении большими дозами (до 10 8 клеток) броненосцев (армадиллов), у которых она вызывает специфический генерализованный процесс и накапливается в огромном количестве в пораженных тканях (лимфатические узлы, печень, селезенка). В связи с этим морфологические свойства возбудителя лепры описаны по его картине в лепрозных тканях.

М. leprae — прямая или слегка изогнутая палочка с закругленными концами, диаметром 0,3—0,5 мкм и длиной 1,0—8,0 мкм. Спор, капсул не образует, жгутиков не имеет, грамположительна. По химическому составу сходна с М. tuberculosis, обладает спирто- и кислотоустойчивостью, поэтому ее окрашивают по методу Циля—

Нильсена. М. leprae обладает большим полиморфизмом: в лепромах (лепрозных бугорках) встречаются зернистые, кокковидные, булавовидные, нитевидные, ветвящиеся и другие необычные формы. В пораженных клетках они образуют шаровидные плотные скопления, в которых микобактерии располагаются параллельно друг другу, напоминая расположение сигар в пачке.

Главные особенности болезни во многом определяются следующими свойствами возбудителя:

1) Очень медленное размножение в организме является причиной продолжительного инкубационного периода (в среднем 3—7 лет, иногда до 15—20 и более лет) и хронического течения болезни у людей и подопытных животных.

2) М. leprae регулярно вовлекает в процесс нервную ткань и приводит к инвалидности, а это имеет большое экономическое значение для эндемичных регионов.

3) Оптимальная температура для размножения возбудителя менее 37 °С. Следовательно, наиболее поражаемы охлаждаемые ткани человека и подопытных животных (у броненосцев температура тела 30—35 °С).

4) М. leprae способны вызывать иммунологическую толерантность у людей с лепроматозной формой болезни, и такие больные являются главным источником заражения людей лепрой.

Определяющим фактором формирования типа болезни и исхода первичного заражения служит степень напряженности естественного иммунитета против лепры, которая выявляется с помощью лепроминовой пробы. Положительная реакция на лепромин свидетельствует о наличии достаточно высокого естественного иммунитета к М. leprae. Нарушение клеточного иммунитета при лепроматозном типе болезни проявляется прежде всего в том, что фагоцитоз имеет незавершенный характер: микобактерии лепры не только не разрушаются макрофагами, но именно в них они активно размножаются. Кроме того, лимфоциты у таких больных не подвергаются бласттрансформации и не подавляют миграции макрофагов (у больных туберкуло- идным типом эти реакции положительны). Иммунитет к лепре зависит от многих факторов, и при его снижении возможно обострение процесса и отягощение течения болезни.

Лабораторная диагностика. Из всех микробиологических методов диагностики используется главным образом бактериоскопический. Материалом для исследования являются слизь или соскобы со слизистой оболочки носа, скарификаты из пораженного участка кожи, кусочки пораженного органа или ткани, из которых готовят гистологические срезы. Мазки и срезы окрашивают по Цилю—Нильсену. Для дифференциации №. leprae от М. tuberculosis используют биологическую пробу на белых мышах, для которых М. leprae не патогенна.

Лечение. Больные лепрой, в зависимости от ее типа, подвергаются лечению или в специальных противолепрозных учреждениях (лепрозориях), или в амбулаториях по месту жительства. В лепрозории госпитализируют первично выявленных больных, у которых имеются распространенные кожные высыпания, возбудитель обнаруживается бактериоскопически; а также больных, находящихся на постоянном учете, в случае обострения или рецидива болезни. Амбулаторно можно лечить больных с ограниченными кожными проявлениями, у которых при бактериоскопии возбудитель не обнаруживается.

Лечение должно носить комплексный характер с одновременным использованием 2—3 различных антилепрозных химиопрепаратов, а также общеукрепляющих и стимулирующих иммунную систему средств. Наиболее активными химиопрепара- тами являются: производные сульфонового ряда — диафенилсульфон, солюсуль- фон, диуцифон и др.; рифампицин, лампрен, этионамид и др. Курс химиотерапии должен быть не менее 6 мес., при необходимости проводят несколько курсов, чередуя препараты.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

В зависимости от двух основных способов заражения первичный туберкулезный очаг локализуется или в легких, или в мезентеральных лимфатических узлах. Однако некоторые специалисты считают, что вначале происходит лимфогематогенное распространение возбудителя в обоих случаях заражения, а потом он избирательно поражает легкие или другие органы и ткани. При попадании через дыхательные пути (или другим способом) в альвеолы и бронхиальные железы туберкулезные палочки вызывают образование первичного аффекта в виде бронхопневмонического фокуса, из которого они по лимфатическим сосудам проникают в регионарный лимфатический узел, вызывая специфическое воспаление. Все это вместе: бронхопневмонический фокус + лимфангоит + лимфаденит — и образует первичный туберкулезный комплекс (первичный очаг туберкулеза).

Туберкулезная палочка, благодаря наличию в ее клетках различных жирных кислот и других антигенов, вызывает в тканях определенную биологическую реакцию, которая приводит к формированию специфической гранулемы — бугорка. В центре его обычно располагаются гигантские клетки Пирогова—Лангганса со множеством ядер. В них обнаруживаются туберкулезные палочки. Центр бугорка окружен эпите- лиоидными клетками, которые составляют главную массу бугорка. По периферии его располагаются лимфоидные клетки. Судьба первичного очага может быть различной. В тех случаях, когда общая резистентность ребенка в силу ряда причин снижена, очаг может увеличиваться и подвергаться творожистому (казеозному) распаду в результате действия токсических продуктов туберкулезной палочки и отсутствия в бугорках кровеносных сосудов. Такая казеозная пневмония может стать причиной тяжелой первичной легочной чахотки, а при попадании возбудителя в кровь — генерализованного туберкулеза, приводящего ребенка к смерти. В большинстве же случаев при наличии достаточно высокой естественной резистентности организма первичный очаг через некоторое время окружается соединительнотканной капсулой, сморщивается и пропитывается солями кальция (обызвествляется), что рассматривается как завершение защитной реакции организма на внедрение туберкулезной палочки и означает формирование уже приобретенного нестерильного (инфекционного) иммунитета к туберкулезу, так как микобактерии могут сохранять жизнеспособность в первичном очаге многие годы.

В случае заражения алиментарным путем туберкулезные палочки попадают в кишечник, захватываются фагоцитами слизистой оболочки и заносятся по лимфатическим путям в регионарные кишечные лимфатические узлы, вызывая их характерные поражения. По мнению некоторых специалистов, туберкулезные палочки в этом случае через ductus thoracicus и правые отделы сердца также могут проникнуть в легкие и стать причиной туберкулеза легких.

Туберкулезная палочка может поражать практически любой орган и любую ткань с развитием соответствующей клиники заболевания.

124. Методы обогащения исследуемого материала при МБ диагностике туберкулеза.

Для более быстрого выделения возбудителя туберкулеза предложен метод микрокультур Прайса.. На нескольких предметных стеклах (ближе к одному концу) делают толстые мазки из исследуемого материала. Мазки высушивают, обрабатывают несколько минут 2—6% серной кислотой , стекло помещают в цитратную лизированную кровь и инкубируют при температуре 37 «С. Уже через 3— 4 сут. рост микобактерий на стекле проявляется в виде микроколоний, которые к 7—14-му дню достигают максимального развития, а микобактерии хорошо выявляются при микроскопии. извлекают стекла, фиксируют препарат, окрашивают по Цилю — Нельсону и микроскопируют ,вирулентные штампы образуют микрокультуры, имеющие вид жгутов ( змеевидные колонии), а невирулентные растут в виде аморфных скоплений.

125.Бактериоскопическая диагностика туберкулеза.

При бактериоскопическом исследовании исходного материала (мокрота, моча, гной, спинномозговая жидкость, испражнения) необходимо учитывать, что содержание в нем микобактерий может быть незначительным, выделение их эпизодическим и в нем могут быть измененные варианты возбудителя, в том числе L-формы. Поэтому для повышения вероятности обнаружения микобактерий туберкулеза используют методы концентрирования их с помощью центрифугирования или флотации, а также фазово-контрастной (для обнаружения L-форм) и люминесцентной микроскопии (в качестве флуорохромов используют аурамин, аурамин-родамин, акридиновый оранжевый и др.

Мокроту помещают в чашки Петри и ставят на черную поверхность. Петлей или препаровальными иглами выбирают гнойный комочек, переносят его на предметное стекло ближе к одному из концов и, растирая между двумя стеклами, готовят мазок. Ликвор отстаивают в холодильнике и готовят мазки из нежной пленки фибрина, в которой находятся микобактерий туберкулеза и клеточные элементы. Мочу центрифугируют и делают мазки из осадка. Препараты из мочи обязательно обесцвечивают не только кислотой, но и спиртом для дифференциации микобактерий туберкулеза от М. smegmatis, которые могут находиться в моче здоровых людей. В отличие от микобактерий туберкулеза они обесцвечиваются спиртом.

Мазки окрашивают по Цилю — Нельсену и микроскопируют, просматривая до 100 полей зрения в препарате. Микобактерий туберкулеза окрашиваются в ярко-красный цвет, располагаются поодиночке или небольшими скоплениями .Единичные бактерии можно обнаружить в препарате, если их содержание не менее 10s в 1 мл мокроты. Поэтому при небольшом содержании микобактерий туберкулеза в материале применяют методы «обогащения» — гомогенизации и осаждения или флотации.

126. Бактериологическая диагностика туберкулеза, преимущества и недостатки.

основной способ диагностики и контроля эффективности лечения. Обязательная проверка чувствительности возбудителя к химиопрепаратам. Соблюдение условий: высокое качество питательной среды, кислая рН, достаточный доступ О2, достаточная посевная доза, возможность выделения L-форм возбудителя, необходимая продолжительность исследования. Для идентификации различных видов микобактерий учитывается скорость роста, пигментообразование и влияние на него фотоактивации, способность синтезировать ниацин, изучение спектра ферментов.

Для выделения L-форм применяют специальные полужидкие среды, рост в них в виде крупинок с облачком помутнения, для микроскопии лучше пользоваться фазово-контрастным микроскопом и непрямым методом иммунофлуоресценции

Микроскопия мазка. Этот метод полностью сохраняет свое значение вследствие доступности для практических клинико-диагностических лабораторий, низкой стоимости и быстроты выполнения недостатки (малое количественное содержание возбудителя, непостоянство его выделения, изменение формы). Необходимость использования методов обогащения.

Люминесцентная микроскопия. Метод основан на проникновении в микробную клетку карболового производного флюоресцентного красителя (аурамина, родамина). При окраске флюоресцентным красителем аурамином-родамином микобактерии можно видеть при неиммерсионном 100-кратном увеличении. Более точен результат при окраске по Цилю-Нильсену карболфуксином и иммерсионной микроскопии при 1000-кратном увеличении. Именно окраска мазка по Цилю-Нильсену рекомендована при применении технологий DOTS. Микобактерии в этом случае выглядят светящимися желтыми палочками Метод имеет неоспоримые преимущества, т. к. позволяет при меньшем увеличении микроскопа просмотреть весь мазок; экономически более эффективен, т.к. уменьшается время, затраченное на просмотр мазков. Недостатки : Низкая чувствительность и специфичность, невозможность дифференциации кислотоустойчивых микобактерий.

Культуральный метод. Наиболее распространенным методом выявления микобактерий туберкулеза в нашей стране является культуральный метод. Это «золотой стандарт» бактериологической диагностики туберкулеза, так как чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для её последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости. Этот метод дает положительные результаты при наличии в исследуемом материале от 20 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл. Однако он трудоемок и длителен в связи с тем, что микобактерии туберкулеза растут очень медленно и их обнаружение может быть зарегистрировано только через 3 недели культивирования.Питательные среды на яичной основе (Левенштейна-Йенсена, Финна-2, Огавы, Аникина, «Новая», Попеску) получили наибольшее распространение среди плотных питательных сред, применяемых для выделения МБТ. Посев материала на среду Левенштайна-Йенсена проводят в бактериологической лаборатории. Рост первых колоний на классических средах отмечают через 4 — 8 недель. Однако появившиеся в последние годы агаровые среды Миддлбрука (7Н10, 7Н11) позволяют быстрее обнаружить рост микобактерий (от двух до четырех недель) и обеспечивают лучшие возможности для изучения морфологии колоний, чем на яичных средах. Недостатком агаризованных питательных сред является необходимость инкубации посевного материала в термостате с углекислым газом, поэтому агаризованные среды в России практически не применяются.Преимущества: чувствительность метода существенно выше микроскопического и дает возможность получить чистую культуру микобактерий для ее последующей идентификации и исследования лекарственной устойчивости.

127. Аллергический метод диагностики туберкулеза.

Реакция Манту ставится с туберкулином, очищенным от белковой фракции, полученной из микобактерии туберкулеза. Пробу осуществляют для характеристики состояния аллергии у людей с целью определения инфицированности, оценки и течения туб. процесса, определения эффективности вакцинации и отбора контингента для ревакцинации против туберкулеза.

128Специфическая профилактика и лечение туберкулеза.

. Профилактика. Помимо проведения широких социально-экономических мероприятий, направленных на улучшение жизни населения, раннего и своевременного выявления больных туберкулезом и оказания им эффективной лечебной помощи, большое значение имеет плановая массовая вакцинация против туберкулеза. Она осуществляется вакциной БЦЖ, полученной А. Кальметтом и Ш. Гереном из ослабленного многолетними пересевами штамма М. bovis. Вакцинации подлежат все новорожденные дети на 5—7-й день жизни. Вакцину, содержащую 0,05 мг сухих живых бактерий в объеме ОД мл, вводят внутрикожно. Ревакцинацию проводят в возрасте 7—12—17—22 и 27—30 лет только лицам, отрицательно реагирующим на внутри- кожную пробу Манту (5 ТЕ/0,1 мл). Взрослым – флюорография 1 раз в год для выявления туберкулеза на ранних стадиях

129. Понятие о микобактериозах, их возбудители.

Микобактериоз – инфекционное заболевание человека и животных, возбудителями которого являются представители большой группы нетуберкулезных микобактерий. Возбудитель – потенциально патогенные микобактерии, характеризующиеся широким спектром естественной лекарственной устойчивости ( устойчивы к изониазидам и стрептомицину, чувствительны к рифампицину и этамбутолу. )Локализация и клин, картина М. близка к туберкулезу. Обычно встречаются М. легких (возбудитель М. kansassii и др.), М. кожи (М.ulcerans), М. лимфатических узлов (М.intracellulare), М. мочеполовой системы(М.kansassii и др.). Возбудители М. Микробиол. д-ку проводят таким же образом, как при соответствующих формах туберкулеза.

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-19; Нарушение авторского права страницы

источник

56. При лабораторной
диагностике туберкулеза
выполняют следующие
требования:

а) обработка материала перед исследованием кислотой, для устранения сопутствующей флоры;

б) прогревание материала
для устранения сопутствующей флоры;

в) материал до посева следует транспортировать и хранить
при температуре 37 °С;

Г) материал предварительно центрифугируют.

57. Проба Манту используется для:

а) диагностики туберкулеза;

в) отбора лиц, подлежащих
вакцинации вакциной БЦЖ;

г) отбора лиц, подлежащих
вакцинации вакциной АКДС.

58. Для лечения туберкулеза используются:

а) антибиотики
и химиопрепараты;

59. В клинической практике для диагностики проказы
используют:

а) бактериологический метод;

б) бактериоскопический метод;

60. Для выявления возбудителя туберкулеза в мазке мокроты
с помощью светового
микроскопа можно
использовать окраску:

а) по Цилю-Нильсену;

61. Для дифференциации
Mycobacterium tuberculosis
от других микобактерий
применяют:

в) метод микрокультур Прайса;

г) образование ниацина;

д) окраска по Цилю-Нильсену.

62. Укажите верные положения применительно к туберкулиновой пробе:

а) пробу считают положительной при появлении папулы,
превышающей 10 мм;

б) наибольшее распространение нашло внутрикожное введение туберкулина (реакция Манту);

в) повторное введение туберкулина способно вызвать
конверсию отрицательной
пробы в положительную;

г) отрицательный ответ не следует рассматривать как факт,
указывающий на отсутствие
туберкулезного процесса;

Д) проба имеет больше эпидемиологическое, чем диагностическое значение.

63. Для лечения лепры
используются:

а) антибиотики и химиопрепараты;

64. Микобактерии туберкулеза являются:

а) мезофилами;

г) факультативными анаэробами;

65. Возбудители туберкулеза:

б) склонны к полиморфизму;

д) отличаются повышенной
скоростью размножения.

66. Укажите питательные
среды для культивирования
микобактерий туберкулеза:

Д) среда Левинштейна–Йенсена.

67. Проба Мицуды используется для:

б) диагностики туберкулеза;

в) отбора лиц, подлежащих
вакцинации вакциной БЦЖ;

Дата добавления: 2015-05-07 ; просмотров: 534 | Нарушение авторских прав

источник

Легочные и внелегочные формы туберкулеза вызываются бактериями комплекса МТС (Mycobacterium tuberculosis complex), а также нетуберкулезными микобактериями комплекса MAC (M.avium complex, M.kansassii).Микобактерии комплекса МАС чаще поражают лиц с иммунодефицитами различной этиологии (прежде всего, больных СПИДом). Методы микробиологической диагностики туберкулеза представлены в схеме 15.

Схема 15.Микробиологическая диагностика туберкулеза

Биопробана морских свинках или кроликах.

Генодиагностика. ПЦР для обнаружения специфических фрагментов ДНК микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) в материале от больного и дифференцировки туберкулезных микобактерий от нетуберкулезных (комплекс МАС — M. avium, M. kansassii).

Материалом для исследования является мокрота, промывные воды бронхов, желудка бронхоальвеолярная жидкость, плевральный эксудат, кровь, моча, испражнения, синовиальная жидкость, биоптаты различных тканей.

Первичная обработка материала заключается в его обработке с целью деконтаминации при наличии посторонней микрофлоры, а также разжижения, гомогенизации и флотации при исследовании мокроты, бронхоальвеолярной жидкости и т.д. Для этого материал обрабатывают муколитическими (N-ацетил-β-цистеин) и антибактериальными (1-2% NaOH) веществами, центрифугируют 20 мин при 3000 g и супернатант удаляют. Осадок ресуспендируют в небольшом количестве ИР.

Микроскопический методзаключается в микроскопическом исследовании мазков из исследуемого материала, окрашенных специальными методами с целью выявления кислото-

устойчивых бактерий, что позволяет дать ориентировочное заключение. Отрицательный результат микроскопического исследования не является основанием для снятия диагноза «туберкулез». В настоящее время основным методом выявления микобактерий является люминес-

центная микроскопия препаратов, окрашенных аурамином в концентрации 1:1000 в течение 15 минут с последующим обесцвечиванием 3% солянокислым спиртом в течение 30 сек, промывкой и докрашиванием мазка в течение 1 минуты водным раствором родамина 6ж в концентрации 1:5000. Микобактерии обладают ярким желтым свечением на темном фоне. Метод Циля-Нильсена применяется реже (рис. 20). Обычно по Цилю-Нильсену окрашивают мазки из чистых культур. Ограничением бактериоскопического метода является то, что он не позволяет дифференцировать микобактерии между собой и от других кислотоустойчивых микроорганизмов.

Рис. 20. Туберкулезная палочка (Mycobacterium tuberculosis) в мокроте больного. Окраска по Цилю-Нильсену. Рубиново-красные палочки (одиночные или скоплениями) на голубом фоне. х 900

Бактериологический метод является основным методом диагностики туберкулеза, обладая высокой чувствительностью и специфичностью.

Для культивирования микобактерий наиболее часто применяют среду Левенштейна- Йенсена, содержащую суспензию свежих яиц, крахмал, глицерин, аспарагин, КН₃РО₄, сульфат и цитрат магния, а также краситель малахитовый зеленый. Среду свертывают в наклонном положении при 85 0 С в течение 45 мин. Применяются также другие яичные среды (Финна, мордовского) и синтетические жидкие питательные среды.Посевы инкубируют в термостате при температуре 37 0 С в атмосфере с повышенным содержанием СО₂ (5-10 %) в течение не менее 8 недель, просматривая посевы каждые 3 дня. Культуры М.tuberculosis растут в шероховатой R-форме в виде крошкообразных или морщинистых колоний кремового цвета (рис. 21). Отсутствие роста микобактерий спустя 8 недель после посева свидетельствует об отрицательном результате бактериологического метода диагностики туберкулеза.

Для культивирования микобактерий применяется также метод микрокультур Прайса. Для этого на нескольких узких предметных стеклах делают толстые мазки, высушивают, обрабатывают несколько минут 2-6 % серной кислотой, после чего нейтрализуют. Затем стекла опускают в пробирки с гемолизированной цитратной кровью в разведении 1:4-1:8 и ставят в термостат. Через 7-14 стекла дней извлекают, препараты фиксируют, окрашивают по методу Циля-Нильсена и микроскопируют. Вирулентные штаммы микобактерий характеризуются ростом в виде жгутов или кос за счет образования корд-фактора.

Рис. 21. Колонии туберкулезной палочки на среде Левенштейна-Иенсена

Идентификация выделенной культуры микобактерий до вида осуществляется по общепринятой схеме на основании изучения типичной морфологии, характерных культуральных свойств (по температурному оптимуму, скорости роста, пигментоообразованию в темноте и на свету), биохимической активности (наличие нитратредуктазы, каталазы, уреазы, пиразинамидазы, продукции никотиновой кислоты — ниациновая проба, восстановления нитратов и теллурита калия, гидролиза твина-80), а также с применением молекулярно-генетических (ДНК-гибридизация) и химических методов, что позволяет сократить время на лабораторную диагностику туберкулеза до 4-7 дней.

Для определения ниацина к культуре микобактерий в жидкой питательной среде добавляют 1 мл раствора KCN и 1 мл 5 % раствора хлорамина; положительная реакция характеризуется появлением ярко-желтой окраски. После учета результатов реакции KCN нейтрализуют добавлением в пробирки 3-5 мл 10 % раствора гидрокарбоната натрия.

Проводится также определение чувствительности микобактерий к антимикробным препаратам методом абсолютных концентраций ( наиболее часто на жидких питательных средах или методом микрокультур по Прайсу, занимая время от 3 недель до 3 месяцев или на плотной среде Левенштейна-Йенсена) с оценкой результатов по задержке роста или по нитратредуктазной активности, что имеет важное значение для назначения адекватной терапии. Границы устойчивости туберкулезной палочки составляют для стрептомицина 5 мкг/мл, ПАСК – 10 мкг/мл, тубазида – 1 мкг/мл, циклосерина и этионамида – 30 мкг/мл. Разработана также ПЦР для определения чувствительности микобактерий к химиопрепаратам и антибиотикам. К другим методам определения лекарственной устойчивости М.tuberculosis относятся биологический (LRP –Luciferase-Reporter Phage – свечение резистентных микобактерий в присутствии генетически измененных бактериофагов, несущих ген люциферазы) и молекулярно-генетический, основанный на ПЦР.

Биопробаранееиспользоваласьдля выделения микобактерий путем подкожного заражения морской свинки (чувствительны к М.tuberculosis) и кролика (чувствительны к M.bovis) материалом от больного с последующим наблюдением за животными (до 4 месяцев). По истечении этого срока или при гибели животных проводилось микроскопическое и бактериологическое исследование органов с целью обнаружения туберкулезных микобактерий. В настоящее время биопроба в реальной практике применяется редко в связи с утратой антибиотикорезистентных штаммов микобактерий вызывать типичную инфекцию и гибель животных.

Генодиагностика. Разработана ПЦР, позволяющая обнаружить видоспецифические нуклеиновые кислоты микобактерий комплекса МТС (М.tuberculosis, M.bovis/BCG, M.africanum) непосредственно в клиническом материале от больного и дифференцировать туберкулезные микобактерии от нетуберкулезных – комплекс МАС (M. avium, M. kansassii). Метод ПЦР сопоставим с бактериологическим исследованием, однако выполняется быстро — в течение 24 часов.

При положительных результатах исследования методами бактериоскопии и ПЦР диагноз туберкулеза подтверждается и рекомендуется немедленное назначение противотуберкулезных препаратов по общепринятой схеме. Отрицательный результат ПЦР при обнаружении кислотоустойчивых микобактерии в мазках исключает наличие туберкулезных микобактерий комплекса МТС, поэтому в данной ситуации назначаются антимикробные препараты, активные в отношении нетуберкулезных микобактерии комплекса МАС. В других случаях необходимо ждать результатов бактериологического исследования.

Серодиагностика.Разработаны РСК, РНГА и другие серологические реакции для определения антител в сыворотке крови больных туберкулезом к антигенам микобактерий туберкулеза, однако диагностического значения эти реакции не имеют.

Аллергодиагностика.Ставится внутрикожная аллергическая проба (реакция Манту) с туберкулином — очищенной белковой фракцией, полученной из фильтрата убитой нагреванием бульонной культуры М.tuberculosis. Учет реакции производится через 24-48 часов. Проба используется для оценки течения туберкулезного процесса, определения эффективности вакцинации и отбора лиц для ревакцинации против туберкулеза.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Основными методами выявления возбудителя туберкулеза остаются бактериоскопический, культуральный и биологический. Чувствительность каждого из этих методов известна. Если для обнаружения бактериоскопическим способом единичных микобактерий туберкулеза в препарате необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 000—500 000 особей, то для выделения культуры микобактерий достаточно 20—100 микробных клеток. Имеются данные, что при заражении животных (особенно чувствительных морских свинок) туберкулезные изменения в их органах могут быть обнаружены при содержании в 1 мл материала единичных (1—5) микобактерий.

Особенности бактериовыделения в условиях интенсификации антибактериальной терапии вызвали необходимость, с одной стороны, применять в повседневной практике способы обогащения или накопления микобактерий в единице исследуемого объекта патологического материала, с другой — усовершенствовать методы исследования.

Применение способов обогащения, а именно метода флотации и седиментации, значительно увеличило выявление возбудителя туберкулеза. Появление флюоресцентной микроскопии, введение щадящих методов обработки материала, одновременного посева патологического материала на питательные среды с разным составом также позволили увеличить результативность микробиологической диагностики туберкулеза.

Исследования, касающиеся разных апскетов бактериовыделения, показали, что у впервые выявленных больных с деструктивными изменениями в легких микобактерии туберкулеза могут определяться в 100% случаев, а у вновь выявленных больных без деструкции — в 20—40%.

Все методы обнаружения, а также идентификации микобактерий основаны на особенностях этой группы микроорганизмов. Свойства кислото-, спирто- и щелочеустойчивости используются для дифференциальных окрасок микобактерий при бактериоскопии, специфичной обработки патологического материала для посева и заражения лабораторных животных.

Чаще объектом исследования являются мокрота больных с различной легочной патологией или промывные воды бронхов. Объектами исследования могут быть как пунктаты из закрытых полостей (цереброспинальная жидкость, экссудаты и транссудаты из плевральной и брюшной полостей, гной из натечни-ков, ткань, полученная при биопсии или во время операции), которые должны быть взяты с соблюдением правил асептики, как и отделяемое открытых полостей (гной из свищей, отделяемое из ран, менструальная кровь и т. д.). Особого внимания требует сбор мочи. Для исследования используют утреннюю порцию, полученную после тщательного туалета наружных половых органов. При отрицательных результатах это исследование повторяют 2—3 раза подряд, используя суточную порцию мочи.

Бактериоскопический метод исследования остается одним из основных методов. Преимущество его заключается в быстроте получения результатов. Однако возможности его ограничены. Известно, что положительный результат при прямой бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю — Нильсену, может быть получен при значительном содержании микобактерий туберкулеза в патологическом материале. Больные, особенно в процессе антибактериальной терапии, могут выделять микобактерии в небольшом количестве. В таких случаях метод может оказаться недостаточно чувствительным для их выявления, что обусловливает применение вышеуказанных методов обогащения или накопления. Наибольшее распространение получил метод флотации, при котором микобактерии туберкулеза, содержащиеся в патологическом материале, при встряхивании водной суспензии этого материала с углеводородом, имеющим меньшую относительную плотность, чем вода, всплывают вместе с образующейся пеной. В качестве углеводорода применяют бензин, бензол, ксилол или толуол.

Для исследования 10—15 мл мокроты переливают в бутылку вместимостью 250 мл и добавляют равное количество 0,5% раствора едкого натра или едкого кали с целью гомогенизации. Через 5—10 мин тщательного встряхивания к гомогенизированной мокроте добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл любого углеводорода. После повторного встряхивания в течение 5—10 мин бутылку доливают до горлышка дистиллированной водой. Через 30 мин после добавления воды на поверхности образуется сливкообразное кольцо, состоящее из капелек углеводорода и микобактерий туберкулеза. Препараты для бактериоскопии готовят из флотационного кольца. На предметные стекла пастеровской пипеткой наносят несколько капель содержимого флотационного кольца, занимая 1/3 площади. После подсыхания мазка вновь той же пипеткой наносят капли флотационного кольца. Такое наслаивание производят 3—4 раза, предварительно высушивая предыдущую каплю. Затем высушенные мазки фиксируют в пламени горелки и окрашивают.

Метод флотации повышает обнаружение микобактерий туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией более чем на 10%. Метод седиментации в настоящее время является одним из обязательных лабораторных исследований в диагностике туберкулеза, включающих бактериоскопии^ и одновременно посев патологического материала на питательные среды.

Обработка патологического материала фосфатом натрия для посева на питательные среды является одновременно и методом накопления. Фосфат натрия — прекрасный гомогенизатор мокроты и щадящий реактив для микобактерий туберкулеза. Обработка им допускает длительную экспозицию с патологическим материалом без значительного нарушения жизнеспособности микобактерий туберкулеза. Одновременно он угнетает рост сопутствующей неспецифической флоры даже при длительном хранении материала.

К исследуемому материалу добавляют равное по объему количество 10% раствора фосфата натрия и инкубируют эту смесь при 37°С в термостате в течение 24 ч. Затем материал центри-фугирируют 5—10 мин при 2000 об/мин, сливают надосадочную жидкость, осадок засевают на питательные среды, а также делают мазок для микроскопирования.

Основным методом окраски мазков из патологического материала для выявления кислотоустойчивых микобактерий является метод Циля — Нильсена, основанный на добавлении к краске (фуксин) протравы (карболовая кислота) и подогревании в процессе окраски, дальнейшем обесцвечивании в серной кислоте или солянокислом спирте и последующем докрашивании метиленовым синим.

Распространен также метод окраски мазка по Шпенглеру. В этом случае для докрашивания применяют пикриновую кислоту, которая позволяет выявлять микобактерии в более глубоких слоях мазка. Фиксированный препарат окрашивают и обесцвечивают, как при применении метода Циля — Нильсена, и после промывания водой на 1—2 мин погружают в насыщенный раствор пикриновой кислоты.

В настоящее время в связи с интенсивной и длительной антибактериальной терапией больные могут выделять микобактерии с измененными морфологическими и тинкториальными свойствами. Это вызывает определенные затруднения как при выявлении возбудителя, так и при дифференциации его от нетуберкулезных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

В таких случаях требуются дополнительные доказательства отличия обнаруженных микобактерий от их непатогенных вариантов. Частично это удается путем более длительного, чем обычно, обесцвечивания мазков кислотой, спиртом (40—60 мин) или жавелевой водой (45—60 мин). Большинство кислотоустойчивых сапрофитов после такой обработки частично или полностью теряют первоначальную окраску. Однако для точной дифференциации микобактерий туберкулеза необходимо использовать комплекс бактериологических и биохимических методов, а в случае необходимости — биопробу.

В последнее время приобретает актуальность определение живых и мертвых микобактерий в мазках из патологического материала, что важно для оценки эффективности химиотера-певтических мероприятий. Принцип определения жизнеспособности микобактерий туберкулеза основан на различной окраске дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микробной клетки у живых и мертвых микобактерий. При этом нативная ДНК (у живых клеток) может воспринимать некоторые основные красители (например, метиленовый зеленый), деполимеризованная ДНК (у мертвых клеток) теряет способность окрашиваться этими красками, но воспринимает окраску дополнительными красителями пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Окрашенные мазки микроскопируют под иммерсией в обычном световом микроскопе. Количественные методы определения бактериовыделения приобретают большое значение для оценки тяжести процесса, выбора тактики лечения и его прогноза. В начальный период антибактериального лечения снижение массивности бактериовыделения является одним из основных показателей эффективности химиотерапии. В связи с этим в лабораторной практике применяются более точные методы количественной оценки бактериовыделения. Наиболее распространен бактериоскопический метод Гаффки — Стинкена, модифицированный Т. Н. Чайкиной, количественной оценки бактериовыделения у больных туберкулезом легких, а также количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

Наиболее результативным бактериоскопическим методом выявления микобактерий туберкулеза является люминесцентная микроскопия, которая позволяет дополнительно выявить микобактерии туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией в 14—30% случаев. Метод основан на способности микобактерий туберкулеза воспринимать окраску специальными красителями — флюорохромами, которые при облучении короткими синими или ультрафиолетовыми лучами начинают светиться. Интенсивность свечения зависит от степени абсорбции красителя, а цвет — от характера флюорохрома и физико-химического состояния бактериальной клетки.

Для окраски мазков применяют смесь аурамина 00 и родамина С (метод Хагемана в модификации Ю. Н. Зубжицкого, метод Боя в модификации И. К. Целлариуса, К. В. Шмалий) или акридиновый оранжевый (метод Адамчика). Микроскопическая картина мазка весьма контрастна, светящиеся микобактерии хорошо видны при малом увеличении объектива. Преимущества метода состоят в высокой его чувствительности, простом способе окраски и экономии времени при микроскопии.

Бактериологические (культуральные) методы выявления микобактерий туберкулеза по сравнению с бактериоскопическими отличаются большей чувствительностью. Положительные результаты можно получить при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных микроорганизмов. Это особенно важно при исследовании олнго-,бациллярного материала от впервые выявленных или мало леченных больных туберкулезом.

Основным преимуществом бактериологического метода выделения микобактерий является возможность получения чистой культуры микобактерий, которые могут быть подробно исследованы и идентифицированы; у них могут быть определены лекарственная чувствительность, вирулентность, биохимические и биологические особенности (ферментативная активность, вид микобактерий, степень жизнеспособности и др.). Однако известны трудности применения этого метода, связанные со сложностью обработки патологического материала, медленным размножением микробных клеток и соответственно появлением видимых колоний микроорганизмов. Все это снижает ценность метода для оперативного использования его результатов в клинике туберкулеза.

Для обработки патологического материала перед посевом на питательные среды используют различные вещества, которые должны обеспечить гомогенизацию материала, максимально сохранить жизнеспособность микобактерий туберкулеза, полностью подавить рост неспецифической микрофлоры, которая может находиться в исследуемом материале, быть простыми и экономичными.

Предварительную обработку патологического материала производят кислотами, щелочами, ферментами, детергентами (поверхностно-активные вещества).

В настоящее время применяют:

1) метод Гона — обработка растворами серной кислоты (от 2 до 6%) в зависимости от характера материала (для мочи —10%) с последующим центрифугированием и отмыванием;
2) метод Петрова — обработка 4% едким натром с последующим центрифугированием и нейтрализацией осадка перед посевом;
3) обработка 10% фосфатом натрия — наиболее широко используемый, удобный и экономичный метод.

Следует подчеркнуть перспективность применения поверхностно-активных веществ, таких как лаурилсуль-фат, лауросепт, хлоргексидинглюконикум, диоцид и др. Преимущества детергентов более четко проявляются при обработке бактериоскопически отрицательных проб мокроты. Рост микобактерий туберкулеза отмечается в 36% случаев после применения лауросепта, в 28% случаев — после применения 4% раствора едкого натра или в 20% — после применения 10% раствора натрия.

В последнее время предложен метод посева необработанного патологического материала на селективные среды (в том числе на среду 7Н10), содержащие различные антибактериальные препараты (полимиксин, амфотерицин, карбенициллин, триметоприм), задерживающие рост неспецифической микрофлоры. При этом частота загрязнения посевов уменьшается в 2—3 раза по сравнению с посевом обработанного патологического материала по стандартному методу Петрова, а также отмечается более интенсивный рост культур микобактерий туберкулеза.

Для культивирования микобактерий туберкулеза существует большое количество различных питательных сред — твердых, полужидких и жидких, последние в свою очередь можно разделить на синтетические и полусинтетические. Однако ни одна из питательных сред не обладает всеми качествами, предъявляемыми к ней современной бактериологической диагностикой. В связи с этим для увеличения результативности культурально-го метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2—3) различных питательных сред. Для выделения чистых культур чаще применяют твердые яичные среды и полужидкие яичные и агаровые среды. В качестве стандартной среды для первичного выращивания и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Всемирной организацией здравоохранения рекомендована твердая яичная среда Левенштейна — Йенсена. На этой среде хороший рост микобактерий получают на 15— 25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

Заслуживают внимания среда «Новая», предложенная Г. Г. Мордовским; среда 2, предложенная Э. Р. Финном; среды 6 и 9, предложенные В. А. Аникиным и соавт. Среда «Новая» содержит желтки куриных яиц, стимулирующие рост микобактерий, а также гликокол, наиболее полно потребляемую из среды аминокислоту [Лазовская А. Л., 1962]. Среда 2 (Финна) отличается по составу от среды Левенштейна — Йенсена отсутствием L-аспарагина, вместо которого используют глутаминат натрия. На этой среде рост микобактерий появляется на несколько дней раньше, однако процент выделения культур и» патологического материала такой же или, по данным некоторых авторов, выше.

Среды 6 и 9 (Аникина) отличаются от описанных выше питательных сред по химическому составу и физическим свойствам. Источником азотистого питания микобактерий в этих средах являются белковые ферментолизаты — препараты микробиологического синтеза, а также аммонийные соли винной и янтарной кислот. Среды обладают высокой информативностью.

Перспективны для дальнейшей разработки и усовершенствования полужидкие среды, создающие более благоприятные условия для роста микобактерий и позволяющие быстрее (череа 7—10 дней) получать положительные результаты. Среди них следует отметить среду Калфина на яичной основе и агаровые среды Миддлбрука 7Н11, 7Н12. В прозрачной среде Миддл-брука рост микроколоний учитывается визуально, в то время как при посеве на среду Калфина увеличивается затрата труда на производство мазков и микроскопирование.

Добавление к агаровой среде ТИП 5 мкг/мл селената натрия позволяет получить видимый рост колоний микобактерий туберкулеза на 3—5-й день по сравнению с 12 днями при посеве суспензии культур на среды, не содержащие селената натрия. Меньшее значение для обнаружения в патологическом материале микобактерий туберкулеза имеет посев на жидкую питательную среду (полусинтетическая среда Школьниковой, синтетическая среда Сотона, кровяная среда и т. д.). Рост микобактерий на этих средах виден невооруженным глазом на дне пробирки на 10—15-й день, а в мазке — в виде кос или скопления кучек. Недостатком этих сред является невозможность получения чистой культуры для дальнейшего исследования и большая частота приростов неспецифической флоры. Помимо глубинного посева на жидкие среды, их используют для метода микрокультивирования на стеклах по Прайсу. Этот метод также дает возможность в короткий срок (10—15 дней) получить рост микобактерий в виде микроколоний, которые после окраски по Цилю — Нильсену хорошо видны под микроскопом. Однако описанная методика довольно трудоемкая и небезопасная, поэтому не рекомендуется для использования. В настоящее время разрабатываются и применяются радиометрические методы быстрого выявления роста микобактерий при посеве патологического материала на специальные селективные среды: селективный агар Mitchison 7Н10 и селективный бульон Миддлбрука 7Н12. Последний включает в себя меченную 14С пальмитиновую кислоту. Регистрацию роста культур производят радиометрически при помощи системы ВАСТЕС. Среднее время определения роста микобактерий туберкулеза из бактериоскопически положительного материала составляет 8,3 дня, из бактериоскопически отрицательного — 13,7 дня по сравнению с 19,4 и 26,3 дня соответственно при обычных методах посева на плотные и полужидкие среды.

Таким образом, для бактериологического исследования может быть использован различный патологический материал. Способы обработки его могут быть различными в зависимости от характера материала, метода посева и применяемой питательной среды. Возможен посев патологического материала и без предварительной обработки, если он не содержит посторонней микробной флоры (цереброспинальная жидкость, серозные экссудаты и т. п.). После инкубации посева в термостате при 37 °С учитывается интенсивность роста микобактерий на твердых средах по четырехбалльной системе: +- единичные колонии (меньше 20), ++- от 20 до 50 колоний, +++- от 50 до 100 колоний, ++++- несосчитываемое количество колоний. В основном положительные результаты посевов определяются до 2 мес инкубации.

Биологический метод исследования до последнего времени считался наиболее чувствительным и эффективным способом обнаружения микобактерий туберкулеза. В настоящее время к этому методу исследования относятся более сдержанно. В связи с введением в клиническую практику интенсивной антибактериальной терапии и появлением значительного количества измененных форм возбудителя, устойчивых к лекарственным препаратам, особенно к препаратам изоникотиновой кислоты, заражение животных может дать отрицательный результат при получении роста культуры на питательных средах. Это объясняется снижением или полной потерей вирулентности лекарственноустойчивых вариантов. При исследовании олигоба-циллярного материала одновременно методом посева и биологической пробой установлен примерно одинаковый процент (6,8—7,2%) выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала. Тем не менее заражение морских свинок в ряде случаев (особенно при отрицательной бактериоскопии и посеве) остается необходимым методом диагностики туберкулеза. При этом целесообразно сочетание одновременного заражения животных и посева патологического материала.

Для увеличения чувствительности биологического исследования многие авторы рекомендуют искусственно снижать резистентность морских свинок ежедневным введением больших доз (12,5 ЕД) кортизона. Использование кортизона со дня заражения животных позволило дополнительно установить присутствие микобактерий туберкулеза в патологическом материале в 15—29% случаев. Положительного результата биопробы можно добиться, применяя последовательные пассажи. Заражая животных органами убитых, ранее зараженных животных, у которых не были обнаружены туберкулезные изменения, иногда на 3—5 пассажах удается получить видимые специфические поражения у морских свинок.

Для этой же цели применяют интратестикулярное заражение морских свинок патологическим материалом. При таком методе заражения удается обнаружить в патологическом материале маловирулентные изониазидоустойчивые микобактерии.

Биологическое исследование используют в диагностических целях для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания у нелеченых больных, для установления бактериовыделения у больных, принимавших препараты непродолжительное время. Особую ценность представляет биологическая проба при исследовании материалов от больных, страдающих урогени-тальным туберкулезом, а также для изучения свойств выделенных культур, определения их вирулентности, принадлежности к тому или иному виду.

Выделение трансформированных форм микобактерий. Широко применяемые рутинные методы не позволяют выявить указанные измененные формы возбудителя и, следовательно, в части случаев дают неадекватную информацию о состоянии процесса.

В настоящее время разработан диагностический комплекс целенаправленного выделения L-форм микобактерий. Исследованию на L-формы микобактерий может быть подвергнут любой патологический материал, который гомогенизируют (механически), затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты, центрифугируют и повторно отмывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Посев осадка производят в 3—5 пробирок с полужидкой (0,3% агар-агара) питательной средой, приготовленной на основе полусинтетической среды Школьниковой с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 20% сахарозы в качестве осмотического протектора и по 5 ЕД/мл антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) для подавления роста неспецифической микрофлоры.

Каждый посев сопровождается обязательным контрольным засевом материала в 2 пробирки с указанной выше средой, одна из которых (контроль 1) не содержит антибиотиков, другая (контроль 2) — сахарозы. Кроме того, материал засевают в 2— 3 пробирки с плотной яичной средой для исключения в исследуемом образце бактериальных форм возбудителя. Учет результатов посева и их интерпретацию производят через 1—2 мес по данным фазово-контрастной микроскопии препаратов согласно схеме выделения и учета L-форм бактерий. Применение этого комплекса показало, что при исследовании патологического материала больных различными формами туберкулеза в процессе химиотерапии L-формы микобактерий туберкулеза можно выделить в 20—100% случаев.

Дифференциация выделенных культур является одним из важнейших звеньев лабораторной диагностики туберкулеза. Она представляет большие трудности вследствие выделения у больных измененных и трансформированных микобактерий туберкулеза, микобактерий бычьего и птичьего видов, атипичных или нетуберкулезных микобактерий, в том числе и кислотоустойчивых сапрофитов. Многие из них по виду не отличаются от микобактерий туберкулеза. Для правильной оценки их патогенетической роли в заболевании человека необходима точная идентификация выделенных культур. Разработан и введен в лабораторную практику основной набор микробиологических и биохимических методов идентификации микобактерий, включающий два комплекса исследований. В первый комплекс исследований входят наиболее простые и легко воспроизводимые методики, на основании которых решается вопрос о принадлежности выделенной культуры к микобактериям туберкулеза или атипичным. При этом учитываются: скорость роста на яичных, агаровых и жидких средах; образование пигмента (в темноте и на свету); возможность роста на простых средах (мясопептонный бульон, агар, перевар Хоттингера); активность каталазы; активность перокси-дазы; термостабильность каталазы. Во второй комплекс исследований входят более сложные методы, на основании которых можно установить вид микобактерий, степень вирулентности, я также группу по Раньону, если выделены атипичные культуры. Этот комплекс включает в себя: определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам (изониазид, ПАСК и др.); определение роста на яичной среде с препаратами, ингибирующими рост микобактерий туберкулеза (салицилат натрия, паранитробензойная кислота, тибон, 5% NaCl); способность продуцировать корд-фактор при глубинном росте на жидких питательных средах; образование ни-ацина (упрощенный вариант ниацинового теста, метод Кубика и Кельбурна в модификации Бараускене); определение амидаз-ной активности (метод Бенике, метод Такэ); гидролиз твина-80 и др.

В литературе встречается описание более 100 различных тестов для дифференциации микобактерий, что указывает на несовершенство каждого из методов для целей идентификации и необходимость применения комплекса исследований.

В настоящее время бактериологические методы исследования приобретают существенное значение для определения тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания.

Определены три направления этих исследований.

1. Использование количественных методов определения бактериовыделения у соответствующих групп больных туберкулезом в процессе химиотерапии. Установление снижения или повышения количества выделяемых микобактерий туберкулеза может служить объективным показателем эффективности проводимого лечения. Для этой цели применяется модифицированный метод Гаффки-Стинкена и количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

2. Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Изменение чувствительности микобактерий отмечается ко всем противотуберкулезным средствам, однако отличается по степени, частоте и скорости появления устойчивых вариантов. Деление микобактерий на чувствительные и устойчивые производится на основании критериев, установленных клинико-лабораторными исследованиями. Мерой чувствительности, или критерием чувствительности, является минимальная концентрация препарата, задерживающая рост микобактерий при стандатных условиях постановки опыта. Эти величины при определении чувствительности микобактерий на жидких и плотных средах несколько отличаются друг от друга. Устойчивыми считают микобактерии, растущие при приведенных ниже показателях (табл. 6).

Во фтизиатрической практике приняты условные понятия первичной и вторичной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Первичной устойчивостью микобактерий считают устойчивость, которая была определена у микобактерий, выделенных от больных, не принимавших противотуберкулезных препаратов. Вторичной устойчивостью считается устойчивость микобактерий, выделенных от больных в процессе лечения противотуберкулезными препаратами. Эти понятия введены для обоснования различного подхода к лечению больных.

По данным Mitchison (1972), Rist (1972), Petersen (1983), Toldisan и соавт. (1983), первичная лекарственная устойчивость к изониазиду в развитых странах составляет около 4— 5% (1,8—5,9%) среди вновь выявленных больных туберкулезом, более тяжелая ситуация наблюдается в развивающихся странах, где первичная устойчивость к этому препарату возросла до 44%. По данным Е. Е. Кузнецовой (1972), IT. М. Рудого (1969), первичная устойчивость микобактерий в России колеблется на различных территориях в пределах 6—10,1%. Вторичная устойчивость микобактерий ко всем препаратам установлена в 40—70% случаев.

Известно, что бактериальная популяция, выделенная из патологического материала, часто содержит смесь устойчивых и чувствительных микобактерий. Кроме того, она может содержать особи с неодинаковой степенью устойчивости к одному или к нескольким лекарственным средствам, а также микобактерии с двойной резистентностью или полирезистентностью.

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза, как правило, проводят раздельно к каждому противотуберкулезному препарату. Для определения двойной устойчивости микобактерий туберкулеза был предложен метод перекрестных посевов и посевов на смеси препаратов, к которым была определена двойная устойчивость.

В настоящее время лекарственную чувствительность микобактерий определяют бактериологическими методами разведений в плотной и в жидкой питательной среде. Имеется значительное количество модификаций этих методов.

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности в жидкой среде являются метод глубинного посева микобактерий и метод микрокультивирования на стеклах (метод Прайса). Методы весьма трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, их окраски и микроскопирова-ния, требуют соблюдения большей стерильности. Однако результаты определения получают в более короткие сроки (12— 14 дней). Применение этих методов оправдано для прямого определения чувствительности микобактерий непосредственно из патологического материала. При этом в патологическом материале должно содержаться не менее 1—5 микобактерий в каждом поле зрения. Совершенствование методов определения лекарственной чувствительности направлено на уменьшение времени получения ответа лабораторного исследования. Предложен метод прямого определения чувствительности микобактерий в жидких средах при постоянном их аэрировании при инкубации в термостате. Рост микобактерий через 7—8 дней определяют нефелометрически или при микроскопии осадка после центрифугирования. Наиболее быстрое (через 4—6 дней) получение результатов лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза возможно при использовании радиометрического метода, включающего посев выделенных от больных культур на жидкую среду 7Н12, содержащую меченную 14С пальмитиновую кислоту (система ВАСТЕС).

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности на плотной среде являются метод абсолютных концентраций (метод Майснер) и метод пропорций. Эти методы менее трудоемки, позволяют использовать патологический материал, содержащий любое число микобактерий, поскольку определение может проводиться у предварительно выделенных из патологического материала микобактерий. Это обстоятельство удлиняет сроки получения результатов. Однако определение чувствительности при этом производится путем засева дозированного числа микобактерий, что позволяет более точно определить степень их чувствительности.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории. В качестве унифицированного метода рекомендуется метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна — Йенсена. Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулезного препарата, ингибирующей рост культуры микобактерий при выращивании их на среде с различным содержанием препаратов. Метод достаточно точен и наиболее прост.

3. Определение в процессе химиотерапии бактериостатиче-ской активности крови больных после приема противотуберкулезных препаратов позволяет исследовать особенности фарма-кокинетики этих препаратов и их сочетаний в организме, выражающиеся в величине их бактериостатического действия. Известно, что величина бактериостатической концентрации препаратов является одним из важных факторов, определяющих эффективность антибактериальной терапии. В свою очередь уровень бактериостатически активного препарата в крови и очагах поражения зависит от физико-химических свойств лекарства, условий его всасывания, распределения, биотрансформации и скорости элиминации. Большое значение имеет доза препарата, метод введения, а также комбинация лекарства с другими туберкулостатическими средствами. Достаточный бак-териостатический уровень препарата в крови больных можно определять несколькими путями.

1. Применение туберкулостатической пробы позволяет определить достаточность концентрации изо-ниазида в крови больных для подавления роста микобактерий, предварительно выделенных от этих больных.
2. Определение концентрации антибактериальных препаратов в крови больных микробиологическим методом серийных разведений или химическим методом и сравнение этих показателей с лекарственной резистентностью выделенных микобактерий туберкулеза может подсказать клиницистам более правильную тактику дальнейшего лечения больного.
3. Определение бактериостатической активности крови больных после приема отдельных препаратов и их комбинаций методом серийных разведений с использованием стандартного тест-штамма «Академия», обладающего чувствительностью ко всем препаратам, лежащей в пределах чувствительности диких штаммов микобактерий, позволяет сравнить активность как отдельных препаратов, так и различных комбинаций и выбрать наиболее целесообразные сочетания. Эти исследования рационально проводить для выяснения причин неэффективности антибактериальной терапии и выбора пути и средств направленной ее коррекции.

источник