Микробиологическое исследование мочи при туберкулезе

В случае поражения мочеполовой системы, в том числе почек, часто необходим анализ мочи на микобактерии туберкулеза, возбудителей заболевания. Исследование позволит выявить почечную форму патологии.

Важно понимать, что правильное лечение возможно только при грамотной диагностике. Ведь туберкулез одна из тех болезней, которые часто трудно обнаружить. Больного могут длительное время безрезультатно лечить от пиелонефрита или простатита. Но причиной всех этих недугов нередко оказывается внелегочный туберкулез.

Возбудителя туберкулеза также называют аббревиатурой БК — бацилла Коха. Открытая форма туберкулеза обозначается как БК+, а закрытая — БК-. Туберкулез почек часто незаметен, маскируется под другие заболевания. Больного могут не беспокоить почки, пока болезнь не перейдет на мочевую систему. Тогда развивается пиелит, моча выходит с гноем. Если не производится лечение туберкулеза, то эти проявления встречаются у каждого пациента.

Полезная информация: Сдача мочи при туберкулезе играет не меньшую роль, чем анализ крови. Если микобактерия проникла в легкие, она могла распространиться и на почки. Поэтому важно вовремя выявить возбудителя.

Микобактерии туберкулеза представляют собой палочки, длина которых не превышает 10 микрометров, то есть одну сотую миллиметра. Они неподвижны, не образуют капсулы и эндоспоры. Их существует множество видов. Особенности каждого вида зависят от питательной среды и со временем появившейся резистентности к некоторым препаратам. Возбудитель относится к низшим грибам и является неспороносным.

Не всегда анализ крови дает полную картину болезни. Туберкулезные бактерии у детей или взрослых можно выявить при обследовании мочи. При этом наличие болезни можно определить тремя различными способами:

Бактериоскопический;
Бактериологический;
Биологическая проба.

Особенно важно следить за состоянием здоровья у детей, для которых туберкулез представляет серьезную опасность. Если есть подозрения, что у ребенка туберкулез почек, ему проводят те же анализы, что и взрослым.

Показатели содержания кровяных телец в моче у детей отличаются от обычных. При беременности результаты исследований могут искажаться, так как на организм женщины приходится двойная нагрузка. Однако, обнаруженная в урине микобактерия является поводом для беспокойства, понадобится обследование.

При данном исследовании берут не мочу, а осадок. Затем окрашивают по методу Циля-Нильсена. Но отрицательный результат не дает стопроцентной гарантии, что туберкулеза нет. Часто о наличии заболевания можно судить по очагам в легких и наличии сопутствующих туберкулезу недугов.

Порядок проведения анализа у детей и взрослых:

Карболовый фуксин попадает в клетку через мембрану.
После происходит обесцвечивание некислотоустойчивых структур за счет попадания H2SO4 и окрашивание метиленовым синим.
В результате все клетки кроме микобактерии меняют свой цвет. Они становятся синими, а микобактерия — красной.

Если бактерископический метод не выявил туберкулез почек и других органов мочеполовой системы, то производится данный тип исследования.

Для этого три раза делают посев мочевой жидкости, взятой утром. Чтобы сделать анализ мочи пациента на туберкулез берут осадок со дна стаканчика. На питательной среде в случае присутствия микобактерий результат появится через две-шесть недель.
При посеве на кровяную среду можно получить ответ через семь дней.
В случае использования картофельной среды результат – через 30-45 дней.
По результатам анализа врач может назначить больному антибиотики, способные нейтрализовать микобактерии.

Полезная информация: Бактериологическая и биологическая пробы в восьмидесяти процентах случаев выявляют у пациентов с туберкулезом микобактерии.

Помимо микобактерии признаком туберкулеза может служить превышенное содержание лейкоцитов и эритроцитов. Сейчас можно проверить содержание кровяных телец не сдавая анализ крови в стационаре. Исследование по Нечипоренко позволяет определить количество кровяных телец, которые содержит мочевая жидкость. Оно дает более точные результаты, чем общий анализ у детей или взрослых.

Важно учитывать, что лейкоцитоурия наблюдается не только при туберкулезе. Уровень лейкоцитов повышается при мочекаменной болезни или уретритах. Проявления эритроцитурии без лейкоцитурии обычно встречаются на ранних стадиях туберкулеза. Необходимо различать туберкулезную микобактерию с неспецифическим уретритом. Если преобладает гоматурия, то, скорее всего, виновник – туберкулез.

Более эффективный способ диагностики на туберкулез вместо манту – это биологическая проба. Для исследования используются морские свинки. Сдаваемый пациентом биологический материал вводят внутрибрюшинно или под кожу свинкам. Через несколько месяцев свинку можно использовать для точной диагностики. Нужно всего лишь выяснить, заразилась ли она. Можно поставить диагноз и раньше, взяв у животного пробу крови с туберкулином. Также морской свинке делают пункцию в димфоузлах. Уже после пяти дней после заражения обнаруживаются лимфодениты.

Полезная информация. Использование для диагностики морских свинок связано с тем, что они чувствительны к туберкулезной палочке, в отличие от многих других видов.

За несколько дней до посещения стационара исключите из меню:

овощи и фрукты, окрашивающие урины, например, свеклу и чернику.
витамин B;
мочегонные и жаропонижающие препараты.

За несколько дней до того, как сдать анализ, не курите сигареты и не пейте спиртное. В период менструаций диагноз может быть ложным, поэтому необходимо дождаться, пока месячные закончатся.

Купите в аптеке стерильную баночку для анализов с завинчивающейся крышечкой из пластика. Необходима емкость объемом 100 мл для взрослого, при взятии у детей достаточно 50 мл.
Перед процедурой вымойте гениталии.
Биологический материал нужно хранить в холодильнике до того момента, пока вы не доставите его в больницу.
Для исследований понадобится около 50 миллилитров жидкости.

На самом деле, понять как сдавать анализ совсем несложно. И от вас требуется только сдать биоматериал.

Важно! Чем дольше собранная урина хранится в холодильнике, тем сильнее искажаются результаты. Поэтому наиболее эффективный способ – сдача биологического материала непосредственно в стационаре.

При подозрении на туберкулез не стоит пробовать делать попытки лечиться самому. Важно обратиться к фтизиатру, который скажет, какие анализы нужны, поставит диагноз и назначит грамотную схему лечения. Ни один из способов исследования не дает стопроцентной гарантии обнаружения туберкулезной палочки. В любом случае потребуется исследование крови и мочи пациента. После получения отрицательного ответа можно попробовать сдать другой вид анализа.

источник

При подозрении на внелегочную форму заражения человека Mycobacterium tuberculosis обязательно назначается анализ мочи на туберкулез. Выявление микобактерий позволяет уточнить локализацию инфекции, на основании чего подбирается наиболее эффективная схема терапия болезни. Анализ мочи на определение бацилл Коха проводится разными методами. При возможности больному назначается каждый метод.

При заражении человека микобактериями туберкулеза чаще всего страдает дыхательная система. Но бывает очаг инфекции локализуется в костной системе, тканях головного мозга, костях и мочеполовых органах. Во время проведения диагностики важно определить очаг поражения. Поэтому помимо стандартных методов исследования, таких как флюорография, анализы крови и мокроты пациенту назначается и ряд дополнительных.

Анализ мочи на туберкулез в первую очередь необходим при подозрении на поражения бактериями мочевыделительной системы. Обязательно он должен назначаться больным:

При продолжительном и при этом неэффективном лечении воспалительных заболеваний органов мочевыделения – пиелонефрита, цистита, пиелита, простатита, эпидидимита;
С нарушением мочеотделения, проявляющимся задержкой мочи, появлением примесей гноя в урине, с гематурией;
При длительных необъяснимых болях в области пояснице.

Анализ на туберкулез почек необходим и пациентам уже с установленным поражением бациллами Коха легочной ткани и других внутренних органов. Его своевременное назначение позволит вовремя обнаружить все очаги инфекции и значит, лечение будет наиболее эффективным.

Почечная локализация бактерий туберкулеза характерна для людей трудоспособного возраста. Чаще всего такая форма заболевания определяется у пациентов от 20 до 40 лет. Очень часто туберкулез почек на ранней стадии развития не проявляется явными симптомами. Поэтому нередко диагностируется уже на запущенной стадии. Исключить подобное помогает вовремя назначенный анализ мочи на микобактерии туберкулеза.

Микобактерии туберкулеза при многократном увеличении выглядят как небольшие прямые или слегка изогнутые палочки, их длина доходит только до одной сотой миллиметра. В организме человека они присутствуют там, где происходит их развитие и размножение. Поэтому при туберкулезе почек бациллы будут активно выделяться вместе с мочой. Обнаружить их в анализе можно тремя способами:

Бактериоскопическим;
Бактериологическим;
Биологическим.

Врач может назначить один из перечисленных методов исследования или все сразу. В дополнение к ним обязательно нужно сдать общий анализ мочи. Так как на заболевание указывает не только присутствие бацилл Коха в пробе, но и косвенные признаки.

При проведении специфических анализов мочи на туберкулез нужно учитывать, что положительный результат всегда свидетельствует о поражении микобактериями тканей системы мочевыделения. Тогда как отрицательный результат не всегда может быть достоверным, что может быть связано с неправильным сбором урины и с другими факторами. Поэтому обычно назначается пересдача анализа и дополнительные методы диагностики.

Проведение общего анализа мочи позволяет выявить косвенные признаки болезни, такие как:

Появление гвоздевидных лейкоцитов;
Стойкая кислая реакция урины (практически в половине случаев заражения микобактериями);
Появление в моче белка (протеинурия);
Эритроцитоурия – присутствие крови в моче;
Пиурия – гной в урине.

Если результат анализа соответствует вышеперечисленным признакам, пациента обязательно нужно отправить на дополнительное обследование, стандартное при подозрении на туберкулез.

Бактериоскопический анализ мочи иначе называется исследованием по Цилю-Нельсону. В его основе лежит устойчивость микобактерий туберкулеза по отношению к кислой среде урины. Взятый образец обрабатывается в лабораторных условиях определенными реактивами:

Сернокислыми растворами или солянокислым спиртом. Они обесцвечивают неустойчивые к кислой среде бактерии. Тогда как кислотоустойчивые микобактерии туберкулеза оказываются окрашенными, что можно увидеть в микроскоп.
Раствором метиленового синего хлорида. Под его воздействием палочки Коха приобретают насыщенный красно-малиновый оттенок.

Бактериоскопический посев мочи на туберкулез является наиболее быстрым. Используют его не только для обнаружения палочек Коха, но и для выявления других, устойчивых к кислым средам бактерий. Туберкулезные микобактерии при проведении анализа имеют характерный цвет и форму изогнутых или ровных палочек.

На достоверность анализа по методу окраски Циля-нельсона влияет правильный забор мочи. Поэтому все рекомендации врача по отбору пробы нужно неукоснительно соблюдать.

Бактериологическое исследование мочи является наиболее точным методом диагностики туберкулеза почек, но делается такой анализ на протяжении от 2-х до 6 недель. Вначале необходимо на протяжении трех дней подряд сдать анализ мочи, осадок урины помещается в чашку Петри с особой питательной средой, это может кровяная среда или картофельные образцы.

В питательной среде происходит рост болезнетворных микроорганизмов, после чего выявленный возбудитель идентифицируется. В кровяной среде микобактерии туберкулеза начинают расти примерно через семь дней, в картофельной для этого может потребоваться месяц и больше.

По результатам бактериологического анализа принимается решение о проведении дополнительных методов диагностики и назначается специфическое лечение.

Стопроцентно достоверный результат показывает анализ мочи при подозрении на туберкулез почек в виде биологической пробы. Ее проведение заключается во введении осадка мочи в брюшную полость или под кожу подопытному животному со склонностью к заражению болезнью. В лабораторных условиях чаще всего с этой целью используют морских свинок, крыс.

В течение месяца за условно инфицированным животным наблюдают. Если в моче пациента имелись палочки Коха то, как правило, за это время грызун погибает и подвергается исследованию с обязательным определением в организме очагов инфекции. Выявить результат биологической пробы можно и раньше, для этого у животного берут кровь на туберкулин или проводят пункцию лимфоузлов с определением наличия воспалительного процесса.

Биологическая проба назначается пациентам редко, так как не во всех лабораториях возможно ее проведение.

Проведение исследования мочи по Нечипоренко по сравнению с общим анализом является более достоверным. Данное исследование дает полную картину о содержании эритроцитов и лейкоцитов в образце урины, определяет количество белковых клеток. Отклонение от нормы не всегда свидетельствует об инфицировании туберкулезом, но точно указывает на инфекционно-воспалительный процесс в мочевыделительной системе. Чтобы определить причину выявленных изменений и установить заболевание пациенту назначаются другие лабораторные методы исследования и инструментальная диагностика.

Моча при туберкулезе покажет присутствие палочек Коха только в том случае, если проба будет взята правильно. Обязательно требуется подготовка, она заключается:

В отказе от употребления за 1-2 дня до забора биологической жидкости продуктов, окрашивающих урину. Это свекла, морковка, черника;
В исключении использования ряда медикаментов для лечения сопутствующих болезней – диуретиков, жаропонижающих средств, витаминов группы В.

Если лечение ранее диагностированной болезни не предполагает перерыв в приеме медикаментов, нужно сообщить об этом врачу. Также нельзя накануне пить спиртные напитки, желательно воздержаться и от курения. Для выявления микобактерий необходим чистый образец урины, поэтому женщины в период менструаций сдавать анализ не должны.

Чтобы точно установить заболевание с поражением почек необходима утренняя порция мочи. Собирают ее, следя нескольким правилам:

Заранее нужно подготовить емкость с крышкой — специальные баночки для проб продаются в аптеках;
Область половых органов тщательно подмыть и лучше делать это без мыла;
Собрать среднюю порцию мочи. То есть мочеиспускание начать в унитаз, затем струю направить в баночку и затем вновь в унитаз. Для исследования достаточно 50 мл урины;
Емкость сразу закрыть завинчивающейся крышкой и поставить в прохладное место.

В большинстве случаев образец мочи на микобактерии туберкулеза собирается дома. Но его необходимо как можно раньше увести в лабораторию. В «свежей» урине палочки Коха определяются легче и поэтому результат таких анализов редко бывает ложноотрицательным.

Туберкулез – заболевание, трудно поддающееся диагностики на ранней стадии. В России повсеместно распространена проба Манту, ее начинают проводить с раннего возраста. Но она не всегда дает точные результаты, поэтому необходимы и другие анализы. На начальном этапе диагностики назначают флюорографию и анализ крови. Если при их проведении возникает подозрение на туберкулез, пациента отправляют на расширенное обследование, в него входит:

Рентгенография;
Туберкулиновые пробы;
МРТ;
Анализ крови по методу ПЦР и ИФА;
Анализ мокроты.

Практически со стопроцентной точностью болезнь устанавливает анализ ПЦР, но он дорогой и проводится не во всех лабораториях.

Флюорография, исследование мокроты являются достоверными, если очаг поражения локализуется в бронхолегочной системе. При внелегочных формах заболевания их результаты не точны, поэтому диагноз выставляется только после расширенного обследования, включающего и проведения анализа мочи.

Диагностические исследования, направленные на выявление туберкулеза, повсеместно распространены. Но к сожалению в большинстве государственных учреждений используются только устаревшие методы, которые не всегда определяют микобактерии при их присутствии в организме. Чтобы получить точные результаты можно обратиться в современные медцентры. Анализы в них в зависимости от их вида проводятся как платно, так и бесплатно.

Если вам известно что-либо новое об исследовании на туберкулез, напишите пожалуйста в комментариях, это может пригодиться многим людям. Желательно поделиться статьей и в соцсетях, так как не все знают, что существуют другие способы обследования, помимо стандартной флюорографии.

источник

В.Ю. Мишин

Для обнаружения возбудителя туберкулеза в биологическом материале больных применяют следующие методы: микроскопию препаратов патологического материала по методу Циля-Нельсена; люминесцентную микроскопию патологического материала; полимеразно-цепную реакцию; бактериологический (культуральный) метод.

Микроскопия препаратов патологического материала по методу Циля- Нельсена является основным методом выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ).

На основании микроскопического исследования можно сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате КУМ. Это объясняется тем, что в природе существует большое разнообразие видов микобактерий, включая и нетуберкулезные, одинаково хорошо воспринимающих окраску раствором карболового фуксина.

Мазки патологического материала обрабатывают карболовым фуксином, а затем обесцвечивают 5% раствором серной кислоты или 3% раствором солянокислого спирта. Докрашивают мазки 0,25% раствором метиленового синего.

Окрашенные препараты просматривают в световом микроскопе с иммерсионной системой. КУМ окрашиваются в красный, а окружающий фон — в синий.

При микроскопическом исследовании препарата, окрашенного по методу Циля-Нельсена, следует просматривать не менее 100 полей зрения, что обычно вполне достаточно, чтобы обнаружить в препарате единичные КУМ. В том случае, если результат исследования оказывается отрицательным, для подтверждения необходимо просмотреть дополнительно 200 полей зрения.

Результат исследования возможно получить в течение 1 ч, но обычно его выдают через 24 ч. Значимыми преимуществами бактериоскопического выявления КУМ в патологическом материале больных туберкулезом является доступность метода, его экономичность и быстрота получения результата. Вместе с тем метод относительно малочувствителен (необходимо, чтобы в 1 мл исследуемого материала содержалось не менее 50—100 тыс. микробных тел) и недостаточно специфичен.

Люминесцентная микроскопия увеличивает разрешающую способность микроскопии по сравнению с окраской по Цилю-Нельсену на 14—30%. Для окраски используют флюорохромы — органические красители, флюоресцирующие при освещении ультрафиолетовыми, фиолетовыми или синими лучами. Такими красителями являются аурамин 00 и родамин С.

Препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа: микобактерии светятся золотисто-желтым цветом на темном фоне. Количество КУМ, обнаруживаемых при микроскопическом исследовании, является очень важным информационным показателем, так как характеризует степень эпидемической опасности больного и тяжесть заболевания.

Поэтому микроскопическое исследование должно быть не только качественным, но обязательно и количественным. При использовании объектива 90х-100х и окуляра микроскопии мазка мокроты 7х— 10х(общее увеличение — 630х— ЮООх) принята следующая градация результатов световой иммерсионной микроскопии по методу Циля-Нельсена, представленная в таблице:

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) является одним из наиболее быстрых и информативных методов выявления МБТ. Принцип метода состоит в увеличении в 106—108 раз числа копий специфического участка ДНК МБТ, катализируемого in vitroRH К-полимеразой в автоматическом режиме.

В искусственных условиях воспроизведение процесса репликации специфического или определенного вида или рода возбудителей участка генома возможно при условии знания его нуклеотидной последовательности. Применение методов детекции продуктов репликации таких участков (ампликоны) позволяет констатировать наличие возбудителя в исследуемой пробе.

К достоинствам метода ПЦР относятся:

высокая чувствительность, позволяющая определять 10—100 клеток в биологической пробе;
высокая специфичность ДНК МБТ в исследуемом материале;
универсальность процедуры обнаружения МБТ из одной биологических проб;
высокая скорость анализа (4—4,5 ч).

Вместе с тем высокая разрешающая способность метода в ряде случаев может приводить к ложноположительным результатам, что ограничивает достоверность исследования.

Бактериологический (культуральный) метод выявления МБТ заключается в посеве мокроты и другого патологического материала на питательные среды. Для эффективного выделения культуры МБТ достаточно единичных жизнеспособных бактериальных клеток (20-100 микробных тел) в образце диагностического материала. Рост культуры регистрируют за 21-90 сут.

Для посева диагностического материала используют разнообразные питательные среды, среди которых можно выделить три основные группы: плотные питательные среды на яичной основе; плотные или полужидкие питательные среды на агаровой основе; жидкие синтетические и полусинтетические питательные среды. В России наиболее широкое распространение получила плотная питательная среда Левенштейна-Йенсена.

Среду Левенштейна-Йенсена применяют во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Рост МБТ на этой среде проявляется в диапазоне от трех недель до трех месяцев (в среднем 1,5 мес).

Вирулентные культуры МБТ обычно растут на плотных питательных средах в виде R-колоний (от англ. rough — грубый, шершавый) различной величины и вида, имеют желтоватый или слегка кремовый оттенок (цвет слоновой кости), шероховатую поверхность, напоминающую манную крупу или цветную капусту.

Интенсивность роста МБТ определяют по трехбалльной системе: «+» 1 — 20 колоний (скудное бактериовыделение); «++» 21—100 колоний (умеренное бактериовыделение); «+++» более 100 колоний (обильное бактериовыделение).

Лекарственную устойчивость МБТ определяют методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна— Йенсена, основанной на добавлении определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл.

Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших на одной пробирке с препаратом, не превышает 20, а посевная доза соответствует 107 микробных тел.

Уровень устойчивости данного штамма МБТ в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (количество мкг в 1 мл питательной среды), при которой еще наблюдается размножение МБТ. Для различных противотуберкулезных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма.

Для метода абсолютных концентраций появление более 20 колоний на питательной среде, содержащей противотуберкулезный препарат, в критической концентрации свидетельствует о том, что данный штамм МБТ обладает лекарственной устойчивостью.

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов при определении лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна-Йенсена составляют для:

изониазида 1 мкг/мл;
рифампицина — 40 мкг/мл;
пиразинамида — 200 мкг/мл;
этамбутола — 2 мкг/мл;
стрептомицина — 10 мкг/мл;
канамицина — 30 мкг/мл;
капреомицина — 30 мкг/мл;
протионамида (этионамида) — 30 мкг/мл;
циклосерина — 30 мкг/мл;
ПАСК — 1 мкг/мл;
офлоксацина — 2 мкг/мл.

В большинстве случаев метод абсолютных концентраций применяется для непрямого определения лекарственной устойчивости. Вначале производят посевы мокроты на твердые питательные среды и получают чистую культуру МБТ, которую пересевают на питательные среды, содержащие определенные концентрации противотуберкулезных препаратов.

Так как сроки выделения МБТ на питательных средах составляют
не менее 1,5 мес, то результаты определения устойчивости указанным методом обычно получают не ранее чем через 2—2,5 мес после посева материала.

Кроме описанных выше классических методов культивирования МБТ и определения лекарственной устойчивости, в России нашли свое применение следующие современные системы.

Система ВАСТЕС460 — радиометрический метод быстрого определения роста МБТ путем регистрации уровня меченного С02, образующегося в процессе утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный С14. Для роста МБТ в данной системе используют флаконы с жидкой питательной средой, которая представляет собой обогащенную среду Middlebrook 7H9, содержащую радиоактивный С14. При размножении МБТ утилизируют С14 и выделяют С1402; в этом случае учет идет по нарастанию С1402.

Система ВАСТЕС MGIT960 — индикаторные пробирки MGIT (М. Growth Indicator Tube) с той же средой Middlebrook 7Н9; содержат в придонной части флюоресцирующий индикатор (трис-4,7-дифкнил-1, Юфенантролин рутениум хлорид пентагидрат), «погашенный» высокими концентрациями 02. В процессе роста МБТ поглощают 02, что сопровождается усилением свечения индикатора, интенсивность которого оценивают при помощи трансиллюминатора.

Полностью автоматизированный комплекс позволяет одновременно исследовать лекарственную чувствительность МБТ в 960 исследуемых образцах.

Наличие роста МБТ в системе ВАСТЕС регистрируется на 4—5-й день от момента посева. В системе ВАСТЕС, где используют те же абсолютные концентрации противотуберкулезных препаратов, учет лекарственной устойчивости идет в течение 6 нед.

В последние годы для быстрого определения лекарственной устойчивости используют метод микрочипов, основанный на молекулярно-генетическом анализе (ПЦР) выявления точечных мутаций в гроВ гене, ответственном за устойчивость к рифампицину, и в katG гене, ответственном за лекарственную устойчивость к изониазиду.

Установлено, что более 95% устойчивых к рифампицину штаммов МБТ содержат точечные мутации (делеции и вставки в гроВ гене, кодирующих Р-субъединицу РНК-полимеразы), и что более 70% устойчивых к изониазиду штаммов МБТ имеют делеции и вставки в katG гене, кодирующих каталазу/пероксидазу. Результаты метода микрочипов могут быть получены на 3-4-й день исследования.

источник

Основными методами выявления возбудителя туберкулеза остаются бактериоскопический, культуральный и биологический. Чувствительность каждого из этих методов известна. Если для обнаружения бактериоскопическим способом единичных микобактерий туберкулеза в препарате необходимо, чтобы 1 мл материала содержал не менее 100 000—500 000 особей, то для выделения культуры микобактерий достаточно 20—100 микробных клеток. Имеются данные, что при заражении животных (особенно чувствительных морских свинок) туберкулезные изменения в их органах могут быть обнаружены при содержании в 1 мл материала единичных (1—5) микобактерий.

Особенности бактериовыделения в условиях интенсификации антибактериальной терапии вызвали необходимость, с одной стороны, применять в повседневной практике способы обогащения или накопления микобактерий в единице исследуемого объекта патологического материала, с другой — усовершенствовать методы исследования.

Применение способов обогащения, а именно метода флотации и седиментации, значительно увеличило выявление возбудителя туберкулеза. Появление флюоресцентной микроскопии, введение щадящих методов обработки материала, одновременного посева патологического материала на питательные среды с разным составом также позволили увеличить результативность микробиологической диагностики туберкулеза.

Исследования, касающиеся разных апскетов бактериовыделения, показали, что у впервые выявленных больных с деструктивными изменениями в легких микобактерии туберкулеза могут определяться в 100% случаев, а у вновь выявленных больных без деструкции — в 20—40%.

Все методы обнаружения, а также идентификации микобактерий основаны на особенностях этой группы микроорганизмов. Свойства кислото-, спирто- и щелочеустойчивости используются для дифференциальных окрасок микобактерий при бактериоскопии, специфичной обработки патологического материала для посева и заражения лабораторных животных.

Чаще объектом исследования являются мокрота больных с различной легочной патологией или промывные воды бронхов. Объектами исследования могут быть как пунктаты из закрытых полостей (цереброспинальная жидкость, экссудаты и транссудаты из плевральной и брюшной полостей, гной из натечни-ков, ткань, полученная при биопсии или во время операции), которые должны быть взяты с соблюдением правил асептики, как и отделяемое открытых полостей (гной из свищей, отделяемое из ран, менструальная кровь и т. д.). Особого внимания требует сбор мочи. Для исследования используют утреннюю порцию, полученную после тщательного туалета наружных половых органов. При отрицательных результатах это исследование повторяют 2—3 раза подряд, используя суточную порцию мочи.

Бактериоскопический метод исследования остается одним из основных методов. Преимущество его заключается в быстроте получения результатов. Однако возможности его ограничены. Известно, что положительный результат при прямой бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю — Нильсену, может быть получен при значительном содержании микобактерий туберкулеза в патологическом материале. Больные, особенно в процессе антибактериальной терапии, могут выделять микобактерии в небольшом количестве. В таких случаях метод может оказаться недостаточно чувствительным для их выявления, что обусловливает применение вышеуказанных методов обогащения или накопления. Наибольшее распространение получил метод флотации, при котором микобактерии туберкулеза, содержащиеся в патологическом материале, при встряхивании водной суспензии этого материала с углеводородом, имеющим меньшую относительную плотность, чем вода, всплывают вместе с образующейся пеной. В качестве углеводорода применяют бензин, бензол, ксилол или толуол.

Для исследования 10—15 мл мокроты переливают в бутылку вместимостью 250 мл и добавляют равное количество 0,5% раствора едкого натра или едкого кали с целью гомогенизации. Через 5—10 мин тщательного встряхивания к гомогенизированной мокроте добавляют 100 мл дистиллированной воды и 0,5 мл любого углеводорода. После повторного встряхивания в течение 5—10 мин бутылку доливают до горлышка дистиллированной водой. Через 30 мин после добавления воды на поверхности образуется сливкообразное кольцо, состоящее из капелек углеводорода и микобактерий туберкулеза. Препараты для бактериоскопии готовят из флотационного кольца. На предметные стекла пастеровской пипеткой наносят несколько капель содержимого флотационного кольца, занимая 1/3 площади. После подсыхания мазка вновь той же пипеткой наносят капли флотационного кольца. Такое наслаивание производят 3—4 раза, предварительно высушивая предыдущую каплю. Затем высушенные мазки фиксируют в пламени горелки и окрашивают.

Метод флотации повышает обнаружение микобактерий туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией более чем на 10%. Метод седиментации в настоящее время является одним из обязательных лабораторных исследований в диагностике туберкулеза, включающих бактериоскопии^ и одновременно посев патологического материала на питательные среды.

Обработка патологического материала фосфатом натрия для посева на питательные среды является одновременно и методом накопления. Фосфат натрия — прекрасный гомогенизатор мокроты и щадящий реактив для микобактерий туберкулеза. Обработка им допускает длительную экспозицию с патологическим материалом без значительного нарушения жизнеспособности микобактерий туберкулеза. Одновременно он угнетает рост сопутствующей неспецифической флоры даже при длительном хранении материала.

К исследуемому материалу добавляют равное по объему количество 10% раствора фосфата натрия и инкубируют эту смесь при 37°С в термостате в течение 24 ч. Затем материал центри-фугирируют 5—10 мин при 2000 об/мин, сливают надосадочную жидкость, осадок засевают на питательные среды, а также делают мазок для микроскопирования.

Основным методом окраски мазков из патологического материала для выявления кислотоустойчивых микобактерий является метод Циля — Нильсена, основанный на добавлении к краске (фуксин) протравы (карболовая кислота) и подогревании в процессе окраски, дальнейшем обесцвечивании в серной кислоте или солянокислом спирте и последующем докрашивании метиленовым синим.

Распространен также метод окраски мазка по Шпенглеру. В этом случае для докрашивания применяют пикриновую кислоту, которая позволяет выявлять микобактерии в более глубоких слоях мазка. Фиксированный препарат окрашивают и обесцвечивают, как при применении метода Циля — Нильсена, и после промывания водой на 1—2 мин погружают в насыщенный раствор пикриновой кислоты.

В настоящее время в связи с интенсивной и длительной антибактериальной терапией больные могут выделять микобактерии с измененными морфологическими и тинкториальными свойствами. Это вызывает определенные затруднения как при выявлении возбудителя, так и при дифференциации его от нетуберкулезных микобактерий и кислотоустойчивых сапрофитов.

В таких случаях требуются дополнительные доказательства отличия обнаруженных микобактерий от их непатогенных вариантов. Частично это удается путем более длительного, чем обычно, обесцвечивания мазков кислотой, спиртом (40—60 мин) или жавелевой водой (45—60 мин). Большинство кислотоустойчивых сапрофитов после такой обработки частично или полностью теряют первоначальную окраску. Однако для точной дифференциации микобактерий туберкулеза необходимо использовать комплекс бактериологических и биохимических методов, а в случае необходимости — биопробу.

В последнее время приобретает актуальность определение живых и мертвых микобактерий в мазках из патологического материала, что важно для оценки эффективности химиотера-певтических мероприятий. Принцип определения жизнеспособности микобактерий туберкулеза основан на различной окраске дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) микробной клетки у живых и мертвых микобактерий. При этом нативная ДНК (у живых клеток) может воспринимать некоторые основные красители (например, метиленовый зеленый), деполимеризованная ДНК (у мертвых клеток) теряет способность окрашиваться этими красками, но воспринимает окраску дополнительными красителями пиронином, сафронином или карболовым фуксином.

Окрашенные мазки микроскопируют под иммерсией в обычном световом микроскопе. Количественные методы определения бактериовыделения приобретают большое значение для оценки тяжести процесса, выбора тактики лечения и его прогноза. В начальный период антибактериального лечения снижение массивности бактериовыделения является одним из основных показателей эффективности химиотерапии. В связи с этим в лабораторной практике применяются более точные методы количественной оценки бактериовыделения. Наиболее распространен бактериоскопический метод Гаффки — Стинкена, модифицированный Т. Н. Чайкиной, количественной оценки бактериовыделения у больных туберкулезом легких, а также количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

Наиболее результативным бактериоскопическим методом выявления микобактерий туберкулеза является люминесцентная микроскопия, которая позволяет дополнительно выявить микобактерии туберкулеза по сравнению с обычной бактериоскопией в 14—30% случаев. Метод основан на способности микобактерий туберкулеза воспринимать окраску специальными красителями — флюорохромами, которые при облучении короткими синими или ультрафиолетовыми лучами начинают светиться. Интенсивность свечения зависит от степени абсорбции красителя, а цвет — от характера флюорохрома и физико-химического состояния бактериальной клетки.

Для окраски мазков применяют смесь аурамина 00 и родамина С (метод Хагемана в модификации Ю. Н. Зубжицкого, метод Боя в модификации И. К. Целлариуса, К. В. Шмалий) или акридиновый оранжевый (метод Адамчика). Микроскопическая картина мазка весьма контрастна, светящиеся микобактерии хорошо видны при малом увеличении объектива. Преимущества метода состоят в высокой его чувствительности, простом способе окраски и экономии времени при микроскопии.

Бактериологические (культуральные) методы выявления микобактерий туберкулеза по сравнению с бактериоскопическими отличаются большей чувствительностью. Положительные результаты можно получить при наличии в исследуемом патологическом материале нескольких десятков жизнеспособных микроорганизмов. Это особенно важно при исследовании олнго-,бациллярного материала от впервые выявленных или мало леченных больных туберкулезом.

Основным преимуществом бактериологического метода выделения микобактерий является возможность получения чистой культуры микобактерий, которые могут быть подробно исследованы и идентифицированы; у них могут быть определены лекарственная чувствительность, вирулентность, биохимические и биологические особенности (ферментативная активность, вид микобактерий, степень жизнеспособности и др.). Однако известны трудности применения этого метода, связанные со сложностью обработки патологического материала, медленным размножением микробных клеток и соответственно появлением видимых колоний микроорганизмов. Все это снижает ценность метода для оперативного использования его результатов в клинике туберкулеза.

Для обработки патологического материала перед посевом на питательные среды используют различные вещества, которые должны обеспечить гомогенизацию материала, максимально сохранить жизнеспособность микобактерий туберкулеза, полностью подавить рост неспецифической микрофлоры, которая может находиться в исследуемом материале, быть простыми и экономичными.

Предварительную обработку патологического материала производят кислотами, щелочами, ферментами, детергентами (поверхностно-активные вещества).

В настоящее время применяют:

1) метод Гона — обработка растворами серной кислоты (от 2 до 6%) в зависимости от характера материала (для мочи —10%) с последующим центрифугированием и отмыванием;
2) метод Петрова — обработка 4% едким натром с последующим центрифугированием и нейтрализацией осадка перед посевом;
3) обработка 10% фосфатом натрия — наиболее широко используемый, удобный и экономичный метод.

Следует подчеркнуть перспективность применения поверхностно-активных веществ, таких как лаурилсуль-фат, лауросепт, хлоргексидинглюконикум, диоцид и др. Преимущества детергентов более четко проявляются при обработке бактериоскопически отрицательных проб мокроты. Рост микобактерий туберкулеза отмечается в 36% случаев после применения лауросепта, в 28% случаев — после применения 4% раствора едкого натра или в 20% — после применения 10% раствора натрия.

В последнее время предложен метод посева необработанного патологического материала на селективные среды (в том числе на среду 7Н10), содержащие различные антибактериальные препараты (полимиксин, амфотерицин, карбенициллин, триметоприм), задерживающие рост неспецифической микрофлоры. При этом частота загрязнения посевов уменьшается в 2—3 раза по сравнению с посевом обработанного патологического материала по стандартному методу Петрова, а также отмечается более интенсивный рост культур микобактерий туберкулеза.

Для культивирования микобактерий туберкулеза существует большое количество различных питательных сред — твердых, полужидких и жидких, последние в свою очередь можно разделить на синтетические и полусинтетические. Однако ни одна из питательных сред не обладает всеми качествами, предъявляемыми к ней современной бактериологической диагностикой. В связи с этим для увеличения результативности культурально-го метода рекомендуется применять посев патологического материала одновременно на несколько (2—3) различных питательных сред. Для выделения чистых культур чаще применяют твердые яичные среды и полужидкие яичные и агаровые среды. В качестве стандартной среды для первичного выращивания и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза Всемирной организацией здравоохранения рекомендована твердая яичная среда Левенштейна — Йенсена. На этой среде хороший рост микобактерий получают на 15— 25-й день после посева бактериоскопически положительного материала.

Заслуживают внимания среда «Новая», предложенная Г. Г. Мордовским; среда 2, предложенная Э. Р. Финном; среды 6 и 9, предложенные В. А. Аникиным и соавт. Среда «Новая» содержит желтки куриных яиц, стимулирующие рост микобактерий, а также гликокол, наиболее полно потребляемую из среды аминокислоту [Лазовская А. Л., 1962]. Среда 2 (Финна) отличается по составу от среды Левенштейна — Йенсена отсутствием L-аспарагина, вместо которого используют глутаминат натрия. На этой среде рост микобактерий появляется на несколько дней раньше, однако процент выделения культур и» патологического материала такой же или, по данным некоторых авторов, выше.

Среды 6 и 9 (Аникина) отличаются от описанных выше питательных сред по химическому составу и физическим свойствам. Источником азотистого питания микобактерий в этих средах являются белковые ферментолизаты — препараты микробиологического синтеза, а также аммонийные соли винной и янтарной кислот. Среды обладают высокой информативностью.

Перспективны для дальнейшей разработки и усовершенствования полужидкие среды, создающие более благоприятные условия для роста микобактерий и позволяющие быстрее (череа 7—10 дней) получать положительные результаты. Среди них следует отметить среду Калфина на яичной основе и агаровые среды Миддлбрука 7Н11, 7Н12. В прозрачной среде Миддл-брука рост микроколоний учитывается визуально, в то время как при посеве на среду Калфина увеличивается затрата труда на производство мазков и микроскопирование.

Добавление к агаровой среде ТИП 5 мкг/мл селената натрия позволяет получить видимый рост колоний микобактерий туберкулеза на 3—5-й день по сравнению с 12 днями при посеве суспензии культур на среды, не содержащие селената натрия. Меньшее значение для обнаружения в патологическом материале микобактерий туберкулеза имеет посев на жидкую питательную среду (полусинтетическая среда Школьниковой, синтетическая среда Сотона, кровяная среда и т. д.). Рост микобактерий на этих средах виден невооруженным глазом на дне пробирки на 10—15-й день, а в мазке — в виде кос или скопления кучек. Недостатком этих сред является невозможность получения чистой культуры для дальнейшего исследования и большая частота приростов неспецифической флоры. Помимо глубинного посева на жидкие среды, их используют для метода микрокультивирования на стеклах по Прайсу. Этот метод также дает возможность в короткий срок (10—15 дней) получить рост микобактерий в виде микроколоний, которые после окраски по Цилю — Нильсену хорошо видны под микроскопом. Однако описанная методика довольно трудоемкая и небезопасная, поэтому не рекомендуется для использования. В настоящее время разрабатываются и применяются радиометрические методы быстрого выявления роста микобактерий при посеве патологического материала на специальные селективные среды: селективный агар Mitchison 7Н10 и селективный бульон Миддлбрука 7Н12. Последний включает в себя меченную 14С пальмитиновую кислоту. Регистрацию роста культур производят радиометрически при помощи системы ВАСТЕС. Среднее время определения роста микобактерий туберкулеза из бактериоскопически положительного материала составляет 8,3 дня, из бактериоскопически отрицательного — 13,7 дня по сравнению с 19,4 и 26,3 дня соответственно при обычных методах посева на плотные и полужидкие среды.

Таким образом, для бактериологического исследования может быть использован различный патологический материал. Способы обработки его могут быть различными в зависимости от характера материала, метода посева и применяемой питательной среды. Возможен посев патологического материала и без предварительной обработки, если он не содержит посторонней микробной флоры (цереброспинальная жидкость, серозные экссудаты и т. п.). После инкубации посева в термостате при 37 °С учитывается интенсивность роста микобактерий на твердых средах по четырехбалльной системе: +- единичные колонии (меньше 20), ++- от 20 до 50 колоний, +++- от 50 до 100 колоний, ++++- несосчитываемое количество колоний. В основном положительные результаты посевов определяются до 2 мес инкубации.

Биологический метод исследования до последнего времени считался наиболее чувствительным и эффективным способом обнаружения микобактерий туберкулеза. В настоящее время к этому методу исследования относятся более сдержанно. В связи с введением в клиническую практику интенсивной антибактериальной терапии и появлением значительного количества измененных форм возбудителя, устойчивых к лекарственным препаратам, особенно к препаратам изоникотиновой кислоты, заражение животных может дать отрицательный результат при получении роста культуры на питательных средах. Это объясняется снижением или полной потерей вирулентности лекарственноустойчивых вариантов. При исследовании олигоба-циллярного материала одновременно методом посева и биологической пробой установлен примерно одинаковый процент (6,8—7,2%) выделения микобактерий туберкулеза из патологического материала. Тем не менее заражение морских свинок в ряде случаев (особенно при отрицательной бактериоскопии и посеве) остается необходимым методом диагностики туберкулеза. При этом целесообразно сочетание одновременного заражения животных и посева патологического материала.

Для увеличения чувствительности биологического исследования многие авторы рекомендуют искусственно снижать резистентность морских свинок ежедневным введением больших доз (12,5 ЕД) кортизона. Использование кортизона со дня заражения животных позволило дополнительно установить присутствие микобактерий туберкулеза в патологическом материале в 15—29% случаев. Положительного результата биопробы можно добиться, применяя последовательные пассажи. Заражая животных органами убитых, ранее зараженных животных, у которых не были обнаружены туберкулезные изменения, иногда на 3—5 пассажах удается получить видимые специфические поражения у морских свинок.

Для этой же цели применяют интратестикулярное заражение морских свинок патологическим материалом. При таком методе заражения удается обнаружить в патологическом материале маловирулентные изониазидоустойчивые микобактерии.

Биологическое исследование используют в диагностических целях для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания у нелеченых больных, для установления бактериовыделения у больных, принимавших препараты непродолжительное время. Особую ценность представляет биологическая проба при исследовании материалов от больных, страдающих урогени-тальным туберкулезом, а также для изучения свойств выделенных культур, определения их вирулентности, принадлежности к тому или иному виду.

Выделение трансформированных форм микобактерий. Широко применяемые рутинные методы не позволяют выявить указанные измененные формы возбудителя и, следовательно, в части случаев дают неадекватную информацию о состоянии процесса.

В настоящее время разработан диагностический комплекс целенаправленного выделения L-форм микобактерий. Исследованию на L-формы микобактерий может быть подвергнут любой патологический материал, который гомогенизируют (механически), затем обрабатывают 3% раствором серной кислоты, центрифугируют и повторно отмывают стерильным изотоническим раствором натрия хлорида. Посев осадка производят в 3—5 пробирок с полужидкой (0,3% агар-агара) питательной средой, приготовленной на основе полусинтетической среды Школьниковой с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, 20% сахарозы в качестве осмотического протектора и по 5 ЕД/мл антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) для подавления роста неспецифической микрофлоры.

Каждый посев сопровождается обязательным контрольным засевом материала в 2 пробирки с указанной выше средой, одна из которых (контроль 1) не содержит антибиотиков, другая (контроль 2) — сахарозы. Кроме того, материал засевают в 2— 3 пробирки с плотной яичной средой для исключения в исследуемом образце бактериальных форм возбудителя. Учет результатов посева и их интерпретацию производят через 1—2 мес по данным фазово-контрастной микроскопии препаратов согласно схеме выделения и учета L-форм бактерий. Применение этого комплекса показало, что при исследовании патологического материала больных различными формами туберкулеза в процессе химиотерапии L-формы микобактерий туберкулеза можно выделить в 20—100% случаев.

Дифференциация выделенных культур является одним из важнейших звеньев лабораторной диагностики туберкулеза. Она представляет большие трудности вследствие выделения у больных измененных и трансформированных микобактерий туберкулеза, микобактерий бычьего и птичьего видов, атипичных или нетуберкулезных микобактерий, в том числе и кислотоустойчивых сапрофитов. Многие из них по виду не отличаются от микобактерий туберкулеза. Для правильной оценки их патогенетической роли в заболевании человека необходима точная идентификация выделенных культур. Разработан и введен в лабораторную практику основной набор микробиологических и биохимических методов идентификации микобактерий, включающий два комплекса исследований. В первый комплекс исследований входят наиболее простые и легко воспроизводимые методики, на основании которых решается вопрос о принадлежности выделенной культуры к микобактериям туберкулеза или атипичным. При этом учитываются: скорость роста на яичных, агаровых и жидких средах; образование пигмента (в темноте и на свету); возможность роста на простых средах (мясопептонный бульон, агар, перевар Хоттингера); активность каталазы; активность перокси-дазы; термостабильность каталазы. Во второй комплекс исследований входят более сложные методы, на основании которых можно установить вид микобактерий, степень вирулентности, я также группу по Раньону, если выделены атипичные культуры. Этот комплекс включает в себя: определение лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам (изониазид, ПАСК и др.); определение роста на яичной среде с препаратами, ингибирующими рост микобактерий туберкулеза (салицилат натрия, паранитробензойная кислота, тибон, 5% NaCl); способность продуцировать корд-фактор при глубинном росте на жидких питательных средах; образование ни-ацина (упрощенный вариант ниацинового теста, метод Кубика и Кельбурна в модификации Бараускене); определение амидаз-ной активности (метод Бенике, метод Такэ); гидролиз твина-80 и др.

В литературе встречается описание более 100 различных тестов для дифференциации микобактерий, что указывает на несовершенство каждого из методов для целей идентификации и необходимость применения комплекса исследований.

В настоящее время бактериологические методы исследования приобретают существенное значение для определения тактики химиотерапии больных, контроля за эффективностью лечения и определения прогноза заболевания.

Определены три направления этих исследований.

1. Использование количественных методов определения бактериовыделения у соответствующих групп больных туберкулезом в процессе химиотерапии. Установление снижения или повышения количества выделяемых микобактерий туберкулеза может служить объективным показателем эффективности проводимого лечения. Для этой цели применяется модифицированный метод Гаффки-Стинкена и количественный метод учета выросших колоний на питательной среде.

2. Определение спектра и степени чувствительности микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Изменение чувствительности микобактерий отмечается ко всем противотуберкулезным средствам, однако отличается по степени, частоте и скорости появления устойчивых вариантов. Деление микобактерий на чувствительные и устойчивые производится на основании критериев, установленных клинико-лабораторными исследованиями. Мерой чувствительности, или критерием чувствительности, является минимальная концентрация препарата, задерживающая рост микобактерий при стандатных условиях постановки опыта. Эти величины при определении чувствительности микобактерий на жидких и плотных средах несколько отличаются друг от друга. Устойчивыми считают микобактерии, растущие при приведенных ниже показателях (табл. 6).

Во фтизиатрической практике приняты условные понятия первичной и вторичной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам. Первичной устойчивостью микобактерий считают устойчивость, которая была определена у микобактерий, выделенных от больных, не принимавших противотуберкулезных препаратов. Вторичной устойчивостью считается устойчивость микобактерий, выделенных от больных в процессе лечения противотуберкулезными препаратами. Эти понятия введены для обоснования различного подхода к лечению больных.

По данным Mitchison (1972), Rist (1972), Petersen (1983), Toldisan и соавт. (1983), первичная лекарственная устойчивость к изониазиду в развитых странах составляет около 4— 5% (1,8—5,9%) среди вновь выявленных больных туберкулезом, более тяжелая ситуация наблюдается в развивающихся странах, где первичная устойчивость к этому препарату возросла до 44%. По данным Е. Е. Кузнецовой (1972), IT. М. Рудого (1969), первичная устойчивость микобактерий в России колеблется на различных территориях в пределах 6—10,1%. Вторичная устойчивость микобактерий ко всем препаратам установлена в 40—70% случаев.

Известно, что бактериальная популяция, выделенная из патологического материала, часто содержит смесь устойчивых и чувствительных микобактерий. Кроме того, она может содержать особи с неодинаковой степенью устойчивости к одному или к нескольким лекарственным средствам, а также микобактерии с двойной резистентностью или полирезистентностью.

Определение чувствительности микобактерий туберкулеза, как правило, проводят раздельно к каждому противотуберкулезному препарату. Для определения двойной устойчивости микобактерий туберкулеза был предложен метод перекрестных посевов и посевов на смеси препаратов, к которым была определена двойная устойчивость.

В настоящее время лекарственную чувствительность микобактерий определяют бактериологическими методами разведений в плотной и в жидкой питательной среде. Имеется значительное количество модификаций этих методов.

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности в жидкой среде являются метод глубинного посева микобактерий и метод микрокультивирования на стеклах (метод Прайса). Методы весьма трудоемки, требуют дополнительного приготовления мазков, их окраски и микроскопирова-ния, требуют соблюдения большей стерильности. Однако результаты определения получают в более короткие сроки (12— 14 дней). Применение этих методов оправдано для прямого определения чувствительности микобактерий непосредственно из патологического материала. При этом в патологическом материале должно содержаться не менее 1—5 микобактерий в каждом поле зрения. Совершенствование методов определения лекарственной чувствительности направлено на уменьшение времени получения ответа лабораторного исследования. Предложен метод прямого определения чувствительности микобактерий в жидких средах при постоянном их аэрировании при инкубации в термостате. Рост микобактерий через 7—8 дней определяют нефелометрически или при микроскопии осадка после центрифугирования. Наиболее быстрое (через 4—6 дней) получение результатов лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза возможно при использовании радиометрического метода, включающего посев выделенных от больных культур на жидкую среду 7Н12, содержащую меченную 14С пальмитиновую кислоту (система ВАСТЕС).

Модификациями метода определения лекарственной чувствительности на плотной среде являются метод абсолютных концентраций (метод Майснер) и метод пропорций. Эти методы менее трудоемки, позволяют использовать патологический материал, содержащий любое число микобактерий, поскольку определение может проводиться у предварительно выделенных из патологического материала микобактерий. Это обстоятельство удлиняет сроки получения результатов. Однако определение чувствительности при этом производится путем засева дозированного числа микобактерий, что позволяет более точно определить степень их чувствительности.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории. В качестве унифицированного метода рекомендуется метод абсолютных концентраций на плотной яичной среде Левенштейна — Йенсена. Принцип метода состоит в определении концентрации противотуберкулезного препарата, ингибирующей рост культуры микобактерий при выращивании их на среде с различным содержанием препаратов. Метод достаточно точен и наиболее прост.

3. Определение в процессе химиотерапии бактериостатиче-ской активности крови больных после приема противотуберкулезных препаратов позволяет исследовать особенности фарма-кокинетики этих препаратов и их сочетаний в организме, выражающиеся в величине их бактериостатического действия. Известно, что величина бактериостатической концентрации препаратов является одним из важных факторов, определяющих эффективность антибактериальной терапии. В свою очередь уровень бактериостатически активного препарата в крови и очагах поражения зависит от физико-химических свойств лекарства, условий его всасывания, распределения, биотрансформации и скорости элиминации. Большое значение имеет доза препарата, метод введения, а также комбинация лекарства с другими туберкулостатическими средствами. Достаточный бак-териостатический уровень препарата в крови больных можно определять несколькими путями.

1. Применение туберкулостатической пробы позволяет определить достаточность концентрации изо-ниазида в крови больных для подавления роста микобактерий, предварительно выделенных от этих больных.
2. Определение концентрации антибактериальных препаратов в крови больных микробиологическим методом серийных разведений или химическим методом и сравнение этих показателей с лекарственной резистентностью выделенных микобактерий туберкулеза может подсказать клиницистам более правильную тактику дальнейшего лечения больного.
3. Определение бактериостатической активности крови больных после приема отдельных препаратов и их комбинаций методом серийных разведений с использованием стандартного тест-штамма «Академия», обладающего чувствительностью ко всем препаратам, лежащей в пределах чувствительности диких штаммов микобактерий, позволяет сравнить активность как отдельных препаратов, так и различных комбинаций и выбрать наиболее целесообразные сочетания. Эти исследования рационально проводить для выяснения причин неэффективности антибактериальной терапии и выбора пути и средств направленной ее коррекции.

источник