Молекулярно генетический метод выявления туберкулеза

Сайт предоставляет справочную информацию исключительно для ознакомления. Диагностику и лечение заболеваний нужно проходить под наблюдением специалиста. У всех препаратов имеются противопоказания. Консультация специалиста обязательна!

Основное количество случаев туберкулёза обнаруживается при первичном обращении больного к докторам общей практики. Пациент, чувствуя недомогание, не сразу обращается за помощью к врачу. Появляется субфебрильная температура до 37,5 С, поддерживающаяся постоянно. Спустя некоторое время, присоединяется сухой кашель, иногда с выделением мокроты ( заядлые курильщики чаще всего не обращают на него внимания, ссылаясь на свою вредную привычку ). Вот тогда и стоит забеспокоиться, настало время обратиться к врачу. Каждый врач знает о широкой распространённости туберкулёза, поэтому при обращении пациента с характерными симптомами, должен задать больному контрольные вопросы, такие как:

Болел ли ранее пациент туберкулёзом
Болели ли его родственники туберкулёзом
Находился ли он в контакте с больными туберкулёзом
Не стоит ли пациент на учете в противотуберкулёзном учреждении по поводу наличия повышенной чувствительности на туберкулин
Проходил ли ( и когда ) пациент флюорографию лёгких
Находился ли пациент в заключении или в контакте с людьми, находившимися ранее в тюрьме
Является ли он мигрантом, бездомным, проживает в неблагоприятных условиях и так далее

Общение с пациентом играет очень важную роль в диагностике туберкулёза. Из рассказа пациента можно узнать некоторые ключевые моменты заболевания, например перенесённые им ранее повторные респираторные инфекции или некоторые признаки скрытой туберкулёзной интоксикации, на которые указывает пациент.
После сбора анамнеза и тщательного обследования пациента приступают к проведению лабораторных и инструментальных исследований.

Небольшой участок кожи на внутренней поверхности предплечья, а именно средней его трети, обрабатывается этиловым спиртом. Иглу вводят внутрикожно, параллельно поверхности кожи, срезом иглы вверх. Вводится 0,1 мл туберкулина, что составляет одну его дозу. На месте введения туберкулина в коже образуется небольшой ( диаметр 7-8 мм ) белесоватого цвета пузырёк в виде лимонной корочки. Очень важно, чтоб пробу Манту производила специально обученная медицинская сестра, так как при неправильной технике выполнения результаты становятся недостоверными. Результаты пробы оцениваются через 72 часа после проведения пробы. Оценка производится доктором либо специально подготовленной медицинской сестрой. Вначале осматривают предплечье в месте введения туберкулина. Так можно обнаружить отсутствие внешних признаков реакции, наличие покраснения кожи или же скопление инфильтрата.

Нельзя путать покраснение кожи с инфильтратом. Для этого необходимо сравнить толщину кожной складки предплечья над здоровым участком, а затем на месте введения иглы. Отличие заключается в том, что при покраснении складки остаются одинаковой толщины, а при инфильтрате, складка над местом введения туберкулина утолщается. После внешнего обследования производят измерение диаметра реакции при помощи прозрачной линейки.

Выделяют три вида ответной реакции на туберкулин:
1. Отрицательная реакция – характеризуется полным отсутствием покраснения кожи и инфильтрата ( 0 – 1 мм ).
2. Сомнительная реакция – покраснение кожи различного размера или наличие инфильтрата диаметром 2 – 4 мм/
3. Положительная реакция – обязательное наличие инфильтрата диаметром 5 мм и более.

В свою очередь положительные реакции так же можно разделить на несколько видов, в зависимости от диаметра инфильтрата:

Слабоположительная – 5 – 9 мм.
Средней интенсивности – 10 – 14 мм.
Выраженная – 15 – 16 мм.
Гиперергическая – у детей и подростков 17 мм и более, а у взрослых от 21 мм. Так же к этой категории относятся везикулонекротические реакции на коже.
Усиливающаяся – реакция, сопровождаемая увеличением инфильтрата на 6 мм и более по сравнению с предыдущей пробой.

1. Сбор и обработка мокроты: процедуру производят в специально подготовленном помещении, подальше от посторонних лиц. Наиболее распространённым методом является забор материала из гортани с помощью тампона. Слизь собирают во время кашля либо отхаркивания мокроты. Тампон помещается в специальный герметический контейнер и немедленно направляется на микробиологическое исследование. Так же сбор материалов производят при исследовании промывных вод бронхов и/или желудка, исследовании спинно-мозговой жидкости, плевральной жидкости, бронхоскопии, биопсии плевры, биопсии лёгкого.

2. Микроскопия мокроты:
Является самым быстрым и дешёвым методом выявления микобактерии туберкулёза. Метод основан на способности микобактерий сохранять свою окраску даже после обработки различными кислотными растворами. Так, они выявляются при помощи микроскопа в окрашенных мазках мокроты. На ряду с простой микроскопией используется и флюоресцентная микроскопия, в основу которой заложено использование, для выявления микобактерий, ультрафиолетовых лучей.

1. Полимеразная цепная реакция: заключается в расшифровке генетического материала микобактерии туберкулёза. Предназначен для обнаружения возбудителя в мокроте и распознавания разновидности бактерий. Метод обладает особой чувствительностью и специфичностью.

2. Определение лекарственной резистентности возбудителя
Чувствительными к какому либо определённому препарату считаются те штаммы микобактерий туберкулёза, на которые данный препарат в минимальной концентрации оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие.
Устойчивыми или резистентными к данному препарату называются те штаммы микобактерий, которые способны размножаться при воздействии на них препарата в минимальной или повышенной концентрации.

3. Серологические методы диагностики туберкулёза
Серологические методы исследования компонентов плазмы крови основаны на обнаружении многочисленных антигенов, относящихся к туберкулёзу, а также разнообразных иммунных ответов, вызванных различными формами туберкулёза.

4. Анализ крови
Гемоглобин и эритроциты в большинстве случаев остаются неизменёнными, за исключением случаев, сопровождаемых острой потерей крови. Показателем, свидетельствующим о наличии активного туберкулёзного процесса, является скорость оседания эритроцитов. Ускоренная СОЭ характерна не только для свежего активного туберкулёза, но и для обострения хронического процесса.
Остальные показатели анализа крови сильно варьируют в зависимости от характера повреждения лёгких.

5. Анализ мочи
В анализе мочи у больного туберкулёзом лёгких не отмечается заметных отклонений от нормы. Изменения появляются только при туберкулёзном поражении почек и мочевыводящих путей.

6. Рентгенологические методы диагностики
Наиболее часто при диагностике туберкулёза лёгких используются следующие методы:

Рентгенография
Рентгеноскопия
Флюорография
Томография

7. Эндоскопические методы диагностики туберкулёза

Трахеобронхоскопия
Бронхоскопический лаваж
Торакоскопия ( плевроскопия )
Трансбронхиальная биопсия
Трансторакальная игловая биопсия
Плевральная пункция и пункционная биопсия плевры

Все данные методы исследования доступны только в специализированно оснащённых медицинских учреждениях.

источник

К прямым методам обнаружения микобактерий туберкулеза можно отнести и бурно развивающиеся в последние годы подходы, сущность которых состоит в выявлении в исследуемых образцах диагностического материала специфических фрагментов цепи ДНК возбудителя. Среди применяемых для этого молекулярно-биологических методик наиболее широкое распространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), в основе которого лежит многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК (так называемая направленная амплификация ДНК): 20 циклов ПЦР приводят к увеличению исходной ДНК в 1 миллион раз, что позволяет визуализировать результаты методом электрофореза в агарозном геле. Очень высокий уровень чувствительности (95 % и более), являющийся главным достоинством метода, достигается за счет того, что в результате многократного копирования уровень специфической олигонуклеотидной последовательности в редакционной пробе возрастает в 106 раз. По своей чувствительности метод ПЦР при туберкулезе органов дыхания в два раза превосходит эффективность культуральной диагностики.

Метод особенно актуален для туберкулеза, поскольку эффективен в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью, определение которых требует длительного культивирования или сложных питательных сред.

ПЦР-диагностика туберкулеза, как правило, строится на использовании последовательностей ДНК специфичных для всех 4 видов группы туберкулеза. Часто для этих целей используют праймеры для выявления последовательностей IS-элементов, например, IS-986 или IS-6110, поскольку данные мигрирующие элементы характерны только для видов микобактерий группы туберкулеза и присутствуют в геноме микобактерий в числе нескольких копий. Выделение ДНК из чистых культур и клинических образцов (мокроты больных) возможно осуществлять любым приемлемым методом, например, методом Boom с использованием лизирующего буфера на основе гуанидина, тиоционата и двуокиси кремния в качестве носителя ДНК.

В развитии фтизиатрии лучевые методы исследования обогатили знания клиницистов в отношении развития, проявления и течения чрезвычайно разнообразных форм туберкулеза и помогли решить ряд практических задач в области борьбы с данным заболеванием.

Распознавание большинства форм туберкулеза в основном основывается на результатах рентгенологического метода исследования, который является связующим звеном между клиникой и патологической анатомией, обладает документальностью и обеспечивает возможность динамического наблюдения.

К методам лучевой диагностики при туберкулезе легких относятся:

цифровая малодозная флюорография;

различные виды томографии, в том числе компьютерная томография (КТ);

ультразвуковое исследование (УЗИ) грудной клетки.

Крупнокадровая флюорография (размер кадров 70×70,100×100 и 110×110 мм), широко использовавшаяся ранее при массовых флюорографических обследованиях населения, уступает место прогрессивным высокотехнологичным цифровым методам исследования.

Цифровая малодозная флюорография. За последнее десятилетие в нашей стране создано несколько типов цифровых флюорографов, в которых с помощью ЭВМ цифровое изображение органов грудной клетки выводится на экран видеомонитора для визуального анализа. Цифровой метод позволяет получить снимок на экране уже через несколько секунд после экспозиции, которая имеет длительность всего лишь 0,01 — 0,05 с.

Рентгеноскопия относится к методам углубленного рентгенологического исследования, проводится строго по показаниям и его объем определяется характером патологического процесса и поставленной задачей.

Особенностью рентгеноскопии является возможность обзора всех образований грудной полости: легких, сердца, крупных сосудов, диафрагмы. Она играет важную роль не только в уточнении топографии патологических образований (отношение к костным компонентам грудной клетки, плевральным листкам, легочной ткани или органам средостения), но и в оценке функции органов.

Рентгенография. В большинстве случаев прямую обзорную рентгенограмму дополняют рентгенографическим исследованием в боковой проекции, что позволяет выявлять изменения в междолевых плевральных пространствах, в области корней легких.

Рентгенограммы в боковых проекциях позволяют определить локализацию патологического процесса по долям и сегментам и служат основой для назначения глубины оптимальных срезов при проведении томографического исследования.

На рентгенограммах грудной клетки, выполненных в косых проекциях (при повороте больного относительно фронтальной плоскости на 30—45°), отчетливее выделяются изменения реберной, верхушечной, междолевой и средостенной плевры, поражения нижних отделов легких.

Томография — послойное рентгенологическое исследование грудной клетки, дающее возможность получения снимков без суммационного эффекта, поскольку элементы других слоев легочной ткани при съемке меняют свое проекционное положение на пленке и не дают четкого изображения. Разработаны различные виды томографии: линейная томография с различной толщиной выделяемого слоя, зависящая от угла поворота рентгеновской трубки; томография с размазыванием — продольным, косым, поперечным. Томографическое исследование можно проводить в вертикальном и горизонтальном положениях и в различных проекциях — прямой, боковой, косых.

Рентгеноконтрастные методы. Для исследования применяют в основном водорастворимые рентгеноконтрастные вещества.

Бронхография — специальный метод получения изображения бронхиального дерева; может быть общей и селективной (осуществляется с помощью направленного введения катетера). Бронхография позволяет получать изображения мелких бронхов до уровня деления бронхов 3-5-го порядка и выявлять их деформацию: расширение, сужение, искривление, изменение топографии; уточнять наличие связи полостных образований с дренажными бронхами.

Фистулографию и плеврографию применяют в клинике грудной хирургии после резекций легких различного объема в случаях осложнений: бронхоторакальный, бронхоплевроторакальный свищ, остаточная плевральная полость, бронхо- и плевропищеводный свищ.

Ангиопульмонография применяется для уточнении морфологии и функции сосудов малого круга: выявления артериовенозных аневризм, варикозного расширения легочных вен, исследования бронхиальных артерий, определения источника кровохарканья. Во фтизиатрической клинике метод имеет наибольшее значение при так называемом разрушенном легком, фиброзно-кавернозном и цирротическом туберкулезе.

Рентгенологическое исследование с использованием в виде контрастного вещества воздуха (пневмомедиастинография) производится для диагностики поражений средостения (опухоли, кисты) или для уточнения отношения патологического образования к легочной ткани, грудной клетке или диафрагме (диагностический пневмоторакс).

Диагностика с помощью КТ основана на прямых рентгенологических симптомах, т. е. определении точной локализации, формы, размеров отдельных органов и патологических очагов, и, что особенно существенно, на показателях их плотности.

Компьютерные томографы 5-го поколения позволяют оценивать состояние легочной паренхимы на уровне дольковых и внутридольковых структур, а спиральная КТ дает трехмерное объемное изображение органа, приближенное к его реальной морфофункциональной характеристике.

Радионуклидная пневмосцинтиграфия применяется в основном у взрослых пациентов для выявления функциональных нарушений регионарного капиллярного кровотока и вентиляции легких.

Вентиляционная сцинтиграфия легких с применением Хеиз (ксенон-133) заключается в ингаляционном введении радиоактивного газа в замкнутую систему «пациент — спирограф» с последующей регистрацией у-излучения 16 детекторами (8 спереди и 8 сзади), располагаемыми над симметричными отделами грудной клетки, и компьютерной обработкой полученных данных.

Ультразвуковое исследование (УЗИ) дает информацию о состоянии плевры, плевральной полости, субплевральных отделах легочной ткани, диафрагмы, синусов.

Метод допплерэхокардиографии является наиболее распространенным непрямым методом измерения давления в легочной артерии; его результаты хорошо коррелируют с данными, полученными при катетеризации правых отделов сердца. С помощью допплерографии можно определить систолическое и диастолическое давление в легочной артерии (непрерывноволновой допплер); или среднее давление (допплер — эхокардиография в импульсном режиме).

источник

Большое значение в правильности выполнения лабораторных поисков МБТ имеет забор патологического материала.Посуда, в которую собирают патологический материал,должна быть стерильной. Наиболее часто исследуется мокрота. Собранные образцы должны быть немедленно отосланы в соответствующую лабораторию. Если такой возможности нет, материал сохраняют в холодильнике при температуре воздуха 4-10 о С. Если лаборатория расположена в отдалении от учреждения здравоохранения, доставку материала для исследований осуществляют 1 или 2 раза в неделю. Для этого должны использоваться специальные контейнеры. Контейнеры должны быть прочными, устойчивыми к разрушению, иметь широкую горловину с герметически завинчивающейся пробкой, чтобы предотвратить случайное вытекание из нее содержимого.

При сборе образцов риск инфекции очень большой, особенно когда больной выкашливает мокроту, в связи с этим процедуру необходимо проводить как можно дальше от посторонних лиц и в специальном помещении/кабине.

Мокроту на МБТ в амбулаторных условиях собирают трижды, после соответствующего туалета полости рта:

1. Первая проба – в поликлинике или стационаре, в присутствии медицинского работника, через 1-2 часа после сна.

2. Вторая проба – в тот же день через несколько часов (3-4 часа).

3. Третья проба – на следующий день пациент приносит мокроту сам.

У нетранспортабельных пациентов забор мокроты производит участковая медсестра поликлиники на дому в стерильную посуду и доставляет в бактериологическую лабораторию.

Методы этиологической диагностики туберкулеза

– с окраской по Циль-Нельсену;

– посевы на плотные питательные среды (Левен-

– посевы на жидкие питательные среды с автома-

тизированным учетом роста типа BACTEC MGIT 960/320 TB

Биочиповая, стриповая, картриджная технологии,

ПЦР в режиме реального времени

Рис. 2. Алгоритм этиологической диагностики туберкулеза

Цель этиологической диагностики туберкулеза:

• выявление эпидемиологически опасных больных туберкулезом – бактериовыделителей (с МБТ+);

• верификация диагноза туберкулеза;

• определение лечебной тактики;

• оценка эффективности лечения и прогноза;

• для эпидемического контроля за туберкулезом.

Бактериоскопический метод выявления МБТ наиболее простой, дешевый, специфический, доступный по сравнению со всеми другими методами диагностики туберкулеза. Бактериоскопический метод имеет свои разновидности: простая бактериоскопия иLEDили люминесцентной микроскопии (рис. 3).

При простой бактериоскопии мазок красят по Цилю-Нильсону: стеклянной палочкой гнойные комочки мокроты наносят равномерно на предметное стекло, и фиксируют в пламени горелки. Далее красят карболовым фуксином, который после нанесения подогревают в пламени, чтобы краситель лучше проник в МБТ, после промывания мазка обесцвечивают в 25 % растворе сернойкислоты или в 3 % соляно-кислом спирте. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3 % раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново-красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы – в голубой цвет. МБТ под микроскопом имеют вид продолговатых палочек, розового цвета на синем фоне. На окрашивание затрачивается 20-30 минут. Метод простой и дешевый, но мало информативный, чтобы обнаружить МБТ в 1 см 3 мокроты должно быть около 50-100 тыс. МБТ, если же будет меньше, то МБТ не будут найдены.

В основу метода люминесцентной микроскопии включена окраска МБТ флюорохромами (аурамин, родамин и др.), которые также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки и светятся в ультрафиолетовых лучах. LED (light emitted diode – светоизлучающие диоды) технологии позволяют конвертировать обычный световой микроскоп во флюоресцентный, увеличивая и улучшая технические возможности люминесцентной микроскопии.

При бактериологическом исследовании патологический материал культивируют на питательных средах, и выделяют культуру МБТ в чистом виде. Наиболее часто используют следующие питательные среды: Левенштейна-Йенсена, Финн-2. Перед посевом на питательные среды проводят обработку патологического материала для уничтожения сопутствующей флоры, разжижения, деконтаминации. В зависимости от материала, степени его гомогенности и загрязнённости для предпосевной обработки используют различные деконтаминанты. Для мокроты в основном используют 10 % раствор трёхзамещённого фосфорно-кислого натрия. После предварительной обработки материал центрифугируют, за счёт этого осаждают микобактерии, и повышают их содержание в осадке («обогащение осадка»). Полученный осадок подвергают нейтрализации, и засевают им (инокулируют) поверхность плотных питательных сред или пробирки с жидкими (полужидкими) средами. Из оставшейся части осадка готовят мазки для микроскопического исследования, так как микроскопическое и культуральное исследования нужно производить параллельно из одной и той же пробы диагностического материала (рис. 2). При использовании плотных сред инокулированные пробирки помещают в термостат при температуре 37 С на 2 суток в горизонтальном положении. Это обеспечивает более равномерное всасывание материала в питательную среду. Через 2 суток пробирки переводят в вертикальное положение, и герметично закрывают резиновыми или силиконовыми пробками во избежание подсыхания засеянных сред. Посевы выдерживают в термостате при 37 о С в течение 10-12 недель при регулярном еженедельном просмотре.

на среде Левенштейна-Йенсена

Рис. 3 Вид МБТ под микроскопом и в культуре

Длительность получения результатов исследований на основе классических метод выявления/культивирования микобактерий туберкулеза (в течение 1-3 месяцев) неблагоприятно сказывается на эффективности химиотерапии, особенно в связи с вероятностью неправильного выбора схемы химиотерапии при наличии ЛУ у возбудителя и риском расширения спектра устойчивости МБТ.

Культивирование на жидкой питательной среде в автоматизированной системе учета роста микроорганизмов – ускоренный культуральный диагностический метод (10- 14 дней)

Культивирование на жидкой среде повышает выявление МБТ примерно на 10% по сравнению с твердыми средами. В настоящее время широко используются системы с автоматической детекцией учета роста МБТ, которые позволяют значительно ускорить получение результат. В бактериологических лабораториях медицинских организаций фтизиатрического профиля РФ преобладающей является автоматизированная система BACTEC MGIT 960/320.

Рис. 3. Автоматизированная система культивирования микобактерий: MGIT-BACTEC-960

Преимущества автоматизированной системы культивирования BACTEC MGIT 960/320 перед культуральными исследованиями на плотных питательных средах обеспечиваются высокой эффективностью стандартизованных и сертифицированных по ISO9001 производств реагентов и сред, а также поддержанием стандартных протоколов исследований.

В основе методики лежит изобретение индикаторной пробирки MGIT (mycobacteria growth indicating tube). Содержимое пробирки MGIT – это питательный бульон, благодаря которому достигается более эффективное выделение микобактерий и их ускоренный рост. Пробирка содержит 7 мл стерильного питательного бульона Мидлбрук 7Н9, в которую перед использованием вносится обогатительная добавка для стимуляции роста МБТ. На дне пробирки содержится кислородзависимый флюорохромный краситель. Во время бактериального роста внутри пробирки происходит поглощение свободного кислорода и его замещение углекислым газом. По мере расходования свободного кислорода возникает флюоресценция. Флюоресценция становится видимой при облучении пробирки ультрафиолетовым светом и автоматически регистрируется фотодатчиками, встроенными в прибор BACTEC MGIT 960/320 (рис. 4). Один раз в час флуоресцентный сенсор считывает результаты тестирования. Интенсивность свечения прямо пропорциональна уровню расходования кислорода и регистрируется в единицах роста (GU –growth units). В среднем появление роста МБТ сокращается до 11 дней. Прибор оценивает пробу как отрицательную при отсутствии роста в течение шести недель (42 дня).

Результат

незначительное или полное отсутствие свечения

Результат

на дне пробирки и оранжевое отражение в колене пробирки

Рис. 4. Результаты индикаторной пробирки MGIT на выделения культуры МБТ

Основное преимущество исследований на основе молекулярно-генетических методов в том, что они являются «быстрыми» методами, позволяющими получить результаты в относительно короткий временной период. Заключение о наличии МБТ в диагностическом материале делается на основании выявления видоспецифичного генетического маркера (ДНК) МБТ или видоспецифичных белков-антигенов, а вывод о ЛУ — на основании выявления мутаций в целевых участках генов МБТ, ассоциированных с ЛУ.

Из всех молекулярно-генетических подходов базовым методом, применяемым для выявления M.tuberculosis complex является полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Проведение ПЦР-анализа происходит в три этапа:

Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции (табл. 3).

Варианты проведения амплификации и визуализации результатов ПЦР

Визуализации результатов ПЦР

ПЦР с последующим электрофоретическим анализом продуктов амплификации

ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на стрипах

ПЦР с последующей гибридизацией продуктов амплификации на биологических микрочипах

ПЦР с определением специфического продукта по значению флуоресценции специфического зонда в конечной точке

ПЦР в режиме реального времени (получение результатов непосредственно во время прохождения реакции)

Выделение ДНК из диагностического материала, полученного от больных туберкулезом – сложный многоэтапный процесс, который может производится вручную или с использованием автоматов для выделения.

Амплификация ДНК. Для осуществления амплификации ДНК используются так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК МБТ, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только МБТ. В большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в многочисленных штаммах МБТ имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа.

Все многочисленно повторяющиеся этапы амплификации происходят при различных температурах. Для проведения ПЦР-анализа используется специально программируемое оборудование – ПЦР–термостат или амплификатор, которое автоматически осуществляет смену температур. Амплификация проводится по заданной программе и составляет 2 часа.

В процессе детекции продуктов амплификации проходит разделение полученной смеси продуктов амплификации. К смеси добавляется специальные растворы, которые наделяют фрагменты ДНК способностью флюоресцировать — отражаться оранжево-красными светящимися полосами. Образующееся свечение выдает присутствие ДНК МБТв забранном у пациента на ПЦР-анализ материале.

Одной из инновационных технологий, основанных на ПЦРв режиме реального времени, является использование анализатора Xpert MTB/RIF (Cepheid, США). Этим оборудованием оснащены многие противотуберкулезные учреждения РФ. Она упрощает молекулярное тестирование, обеспечивая полную интеграцию и автоматизацию трех процессов (подготовка образца, амплификация и детекция), необходимых для молекулярного тестирования. Тест Xpert MTB/RIF имеет аналитическую чувствительность пяти геномных копий очищенных ДНКM. tuberculosis. Молекулярные маяки, которые нацелены на ген «rpoB», охватывают все мутации, обнаруженные в >99,5 % штаммов, устойчивых к рифампицину. Перекрестная реактивность с нетуберкулезными микобактериями отсутствует. ДНК МБТ, устойчивая к рифампицину выявляется в присутствии, как нетуберкулезных ДНК, так и в смешанных чувствительных и устойчивых штаммах. Образцы материала человека в основном могут быть взяты из мокроты, промывных вод бронхов, мочи, плеврального экссудата, ликвора. Итоговые результаты тестов предоставляются в графическом и табличном форматах (рис. 5). Xpert MTB/RIF позволяет сразу при подозрении у пациента туберкулеза взять у него мокроту и в течение двух часов определить есть ли у него МБТ и устойчивые ли они к самому эффективному противотуберкулезному препарату (рифампицин). Данная методика позволяет с первых дней назначить адекватную химиотерапию, и распределить потки поступающих больных в противотуберкулезный диспансер и направить в специализированные отделения (с лекарственно-устойчивым туберкулезом).

Рис. 5 Анализатора Xpert MTB/RIF . Подготовка образцов к проведению теста

При работе системы GeneXpert необходимы минимальное число ручных операций и специализированных знаний. Пользователь просто добавляет биологический образец для тестирования в картридж, ставит его на борт прибора, и система GeneXpert автоматически запускает цикл реакций (рис. 5). Прибор GeneXpert компактен и удобен, может быть установлен вне лаборатории. Малые размеры прибора и незначительные потребности в энергии позволяют системе работать практически в любом помещении. Настольный ПК или ноутбук используется для выполнения программного обеспечения и хранения базы данных, содержащей результаты работы системы GeneXpert. Программное обеспечение позволяет выбирать описания тестов, контролировать процесс тестирования, просматривать результаты теста и экспортировать данные для анализа в приложениях сторонних разработчиков. Программное обеспечение также используется для архивирования результатов, извлечения данных из архива и управления базой данных. Сканер штрих-кодов ускоряет ввод данных, а также снижает вероятность возникновения ошибки при вводе данных.

Дифференциация (типирование) микобактерий туберкулеза

Необходимо отличать микобактерии туберкулеза от сапрофитных микобактерий, которые определяются в 0,3-3% культур.

Кислотоустойчивые сапрофитные микобактерии можно выделить как из внешней среды, так и из материала здорового человека, а также и из патологического материала. Присутствие сапрофитных микобактерий в мокроте, слюне, промывных водах желудка и бронхов, моче, кале и т. д. может быть не связано с наличием заболевания и служить источником серьезных диагностических ошибок. Обнаружение кислотоустойчивых сапрофитов в мокроте больных может привести к ошибочному диагнозу туберкулеза.

Идентификация микобактерий по культуральным свойствам.При посеве на плотные питательные среды на основании скорости роста бактерий, морфологии и окраски колоний (пигментообразование) можно сделать предварительное заключение о принадлежности культуры либо к комплексу МБТ, либо к нетуберкулезных микобактерий (НТМБ). При культивировании МБТ на жидких питательных средах проводится тестирование на контаминацию (микроскопия культуры с окраской по Цилю-Нильсену и посев на кровяной агар) и затем молекулярно-генетическими методами подтверждается принадлежность к микобактериям туберкулезного комплекса;

Идентификация микобактерий с помощью биохимических тестов

Дифференциация микобактерий туберкулезного комплекса и нетуберкулезными видами микобактерий основана на их культуральных свойствах и способности к росту на дифференциально-диагностических средах. Наиболее часто применяемыми и общепринятыми тестами являются способность к росту на среде, содержащей 1000 мкг/мл натрия салициловокислого; к росту на среде, содержащей 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты; к росту на среде, содержащей 5% хлорида натрия. Виды микобактерий туберкулезного комплекса не способны к росту на указанных питательных средах. Для дифференциации вида M.bovisот других видов туберкулезных микобактерий используют культуральный тест на способность к росту на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты. Среди всех представителей этой группы только указанный вид не дает роста на этой питательной среде.

Для контроля контаминации при культивировании на жидкой/плотной питательной среде проводят посев культур на чашки Петри с кровяным агаром. Наличие роста микроорганизмов через 24-72 часа инкубации при +37°С свидетельствует о контаминации материала посторонней микрофлорой.

Эти исследования являются достаточно длительными, трудоемкими и требуют дополнительных капиталовложений, материально-технической базы, надлежащих условий, обеспечивающих биологическую безопасность.

Идентификация микобактерий с помощью молекулярно-биологических методов

Методы видовой идентификации, основанные на выявлении генетических маркеров МБТ с помощью ПЦР, имеют преимущество в специфичности и быстроте анализа по сравнению с культуральными и биохимическими методами.

Молекулярные методы дифференциации МБТ от нетуберкулезных микобактерий основаны на выявлении видоспецифических структур в геноме или белковом спектре возбудителя. Одни методы направлены только на дифференцировку микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, другие — пригодны для точной видовой идентификации возбудителя.

К методам, дифференцирующим микобактерий туберкулезного комплекса от нетуберкулезных микобактерий, относится ПЦР, выявляющая вставочную последовательность ДНКIS6110, присутствующую только у микобактерий туберкулезного комплекса.

Иммунохроматографический методидентификации выросших культур микроорганизмов (метод поддержан ВОЗ), основанный на определении наличияспецифического антигена МБТ МРТ64, отличается простотой выполнения и позволяет получить результат идентификации МБТ за 15 минут. Данный метод может быть рекомендован в качестве основного при проведении идентификации культур, выросших на жидких и/или плотных питательных средах, а также в контаминированных культуральных образцах.

Методики, обеспечивающие точную видовую идентификацию нетуберкулезных микобактрий, более трудоемки и требуют больших материальных затрат. К ним относится гибридизационные технологии на нейлоновых мембранах (ДНК-стрипы), позволяющие идентифицировать следующие виды нетуберкулезных микобактерий: M.avium ssp., M.chelonae, M.abscessus, M.fortuitum, M.gordonae, M.intracellular e, M.scrofulaceum, M.interjection, M.kansasii, M.malmoense, M.peregrinum, M.marinum, M.ulcerans, M.xenopi и M.simiae, M.mucogenicum, M.goodii, M.celatum, M.smegmatis, M.genavense, M.lentiflavum, M.heckeshornense, M.szulgai, M.intermedium, M.phlei, M.haemophilum, M.kansasii, M.ulcerans, M.gastri, M.asiaticumvL M.shimoidei. Этим методом можно исследовать культуры с плотной и жидкой питательных сред и получить результат в течение 1 -2 дней.

Идентификация МБ до вида может проводиться также с помощью секвенирования, MALDI-ToF масс-спектрометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии, результаты которых основаны на выявлении уникальных для каждого видаМБ структур.

Определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП

Цель микробиологических методов исследования лекарственной чувствительности МБТ к ПТП состоит в том, чтобы определить отличается ли клинический изолят от «дикого» штамма МБТ по степени чувствительности к соответствующему антимикробному агенту. При оценке результата микробиологического исследования культура МБТ признаётся устойчивой, если микобактерии дают рост на питательной среде в присутствии критической концентрации заключённого в неё противотуберкулёзного препарата.

Методы определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП

Метод абсолютных концентраций на плотной

среде Левенштейна-Йенсена. Регистрация МБТ:

– по нитратредуктазной активности МБТ.

Метод пропорций на жидких питательных средах

с автоматизированным учетом роста типа

ПЦР в режиме реального времени,

бБиочиповая, стриповая, картриджная технологии

Метод абсолютных концентраций на плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена, основанный на добавлении в культуральную среду определенных стандартных концентраций противотуберкулезных препаратов, которые принято называть критическими при расчете на мкг/мл. Критическая концентрация – это самая низкая концентрация, которая подавляет рост 95% «диких» штаммов МБТ. Для каждой среды или системы культивирования подобраны соответствующие критические концентрации препаратов. Культура МБТ считается чувствительной к той или иной концентрации противотуберкулезного препарата, которая содержится в среде, если число колоний МБТ, выросших в одной пробирке с тем или иным ПТП, не превышает 20, а посевная доза соответствует 10 7 микробных тел.

Модифицированный метод пропорций в жидкой питательной среде в системе с автоматизированным учетом роста микроорганизмов типа BACTEC MGIT 960. В процессе определения происходит сравнение скорости роста МБТ — в контрольной пробирке и в пробирках с лекарственными препаратами. В первую пробирку не вносится лекарственный препарат — контрольную, в остальные пробирки добавляются известные концентрации тестируемых лекарственных препаратов, рост в которых сравнивается с ростом в контрольной пробирке.

Если тестируемый лекарственный препарат активен по отношению к выделенным МБТ, он будет ингибировать рост и подавлять флюоресценцию, при этом в контрольной пробирке рост не ингибируется и, соответственно, уровень флюоресцентности в данной пробирке будет выраженный. Мониторинг роста осуществляется при помощи прибора BACTEC MGIT 960/320, который автоматический интерпретирует результаты на наличие чувствительности или резистентности МБТ к препарату.

На плотной питательной среде Левенштейна-Йенсена проводят определение ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций к ПТП первого ряда (стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол) и к ПТП второго ряда (канамицин, капреомицин, циклосерин, офлоксацин, этионамид, аминосалициловая кислота, амикацин).

На жидких питательных средах проводят определение ЛЧ МБТ к ПТП первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол, стрептомицин, пиразинамид) и к ПТП второго ряда (амикацин, канамицин, офлоксацин, левофлоксацин, моксифлоксацин, этионамид, протионамид, капреомицин, аминосалициловая кислота, линезолид).

Молекулярно-генетические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ

Генотипические методы определения лекарственной чувствительности/устойчивости МБТ основаны на изучении специфических участков генома МБТ и выявлении наличия или отсутствия определенных мутаций в генах, связанных с резистентностью к конкретным ПТП. При этом исследованию могут подвергаться как диагностический материал, так и выросшие культуры микроорганизмов.

Основным достоинством молекулярно-генетических является быстрое и достоверное выявление больных МЛУ ТБ, так как они позволяют выявить ЛУ МБТ к рифампицину и изониазиду, а также к важнейшим препаратам второго ряда, позволяя использовать разделение потоков больных и включать в режим лечения наиболее эффективные препараты.

Молекулярно-генетические тест-системы определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза представлены тремя основными технологиями:

Гибридизационные технологии, основанные на гибридизации продуктов ПЦР со специфическими олигонуклеотидами, иммобилизированными на матрице, которая может представлять собой биологический микрочип, или ДНК-стрип. Гибридизационные технологии позволяют в культуре с плотной или жидкой среды или непосредственно в мокроте, положительной по результатам микроскопического исследования, в течение 1-2 дней выявлять наиболее распространенные мутации в генах МБТ, связанных с устойчивостью к основным ПТП первого ряда — изониазиду и рифампицину и некоторым ПТП второго ряда (в зависимости от тест-системы). Данная группа методов основана на том, что амплифицированные в результате ПЦР целевые последовательности гибридизуются с зондами, нанесенными на соответствующую матрицу. По результатам гибридизации делается вывод о наличии мутаций, влекущих устойчивость к ПТП.

Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени. Метод ПЦР в режиме реального времени позволяет определять мутации, ассоциированные с ЛУ к рифампицину, изониазиду. Преимуществом данного метода перед описанными выше является отсутствие этапа гибридизации и оценка результатов в режиме реального времени, что позволяет снизить возможность кросс-контаминации образцов. Однако, для получения информации, сравнимой с гибридизационными технологиями, необходимо проведение большего числа циклов анализа. Использование зарегистрированных наборов позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью (94 % и 99 %, соответственно) выявлять мутации в генах rpoB, katG и inhA, ассоциирующиеся с устойчивостью к рифампицину и изониазиду.

«Картриджная» технология (выделение ДНК и амплификация идут автоматически в специальном картридже в системе GeneXpert).

Использование этой системы позволяет непосредственно из нативной мокроты в очень короткие сроки (в течение 2,5 часов) одновременно проводить выявление ДНК МБТ и с высокой достоверностью определять устойчивость к рифампицину.

Классификация лекарственной устойчивости МБТ

Первичная лекарственная резистентность – это устойчивость МБТ к ПТП, которая обнаружена у впервые выявленных больных, которые никогда не принимали противотуберкулезную терапию.

Вторичная лекарственная устойчивость (приобретенная) – резистентность МБТ, которая обнаружена у больных, которые принимали ПТП больше 4 недель. Лекарственная устойчивость классифицируется как:

Монорезистентность – устойчивость только к одному ПТП.

Полирезистентность – устойчивость к двум и ПТП, но не к сочетанию изониазида и рифампицина.

Устойчивость к рифампицину – лекарственная устойчивость МБТ к рифампицину независимо от лекарственной устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам, определенная любым методом тестирования лекарственной чувствительности.

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – устойчивость к сочетанию изониазида и рифампицина независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.

Широкая лекарственная устойчивость (ШЛУ) – сочетанная устойчивость к изониазиду, рифампицину, фторхинолону и канамицину и/или амикацину и/или капреомицину независимо от наличия устойчивости к другим противотуберкулезным препаратам.

Причины лекарственной устойчивости:

1) биологические – недостаточная концентрация препарата в очаге туберкулезной инфекции, индивидуальные особенности организма пациента (быстрая скорость инактивации препаратов);

2) причины, обусловленные пациентом – контакт с больными резистентным туберкулезом, отсутствие приверженности лечению (нерегулярный прием препаратов, неосознания важности лечения, преждевременное прекращение приема ПТП), неудовлетворительная переносимость препаратов, в том числе и сопутствующая патология, требующая приостановления (коррекция) противотуберкулезной терапии;

3) факторы, обусловленные течением заболевания – распространенный, быстропрогрессирующий деструктивный процесс;

4) факторы, обусловленные назначенным лечением – неадекватная схема лечения, лечение одним препаратом (монотерапия), недостаточная доза или длительность лечения, использования препаратов с перекрестной стойкостью, использование ПТП низкого качества, где доза препарата не соответствует заявленной.

источник

К методам лучевой диагностики при туберкулезе легких относятся:

цифровая малодозная флюорография;

различные виды томографии, в том числе компьютерная томография (КТ);

ультразвуковое исследование (УЗИ) грудной клетки.

источник