Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:
Предметные и покровные стекла.
Шпатели и иглы.
Смесь Никифорова.
Газовая или спиртовая горелка.
Пастеровская пипетка с резиновым баллончиком.
Водяная баня с мостиком.
Иммерсионное масло.
Микроскоп.
Фильтровальная бумага.
Пинцеты Корне.
Бумажки Синева.
Основной фуксин.
96° этиловый спирт.
Фенол.
Глицерин.
Концентрированная соляная кислота.
Метиленовая синька.
Дистиллированная вода.
Генцианвиолет.
Реактив Люголя.
Едкий натр (NaOH).
Бензин или ксилол.
Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулеза и другой для обнаружения прочих микроорганизмов. Для первого препарата отбирают те же частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго — гнойные частицы. Взятый материал распределяют по предметному стеклу до получения достаточно тонкой ажурной сеточки (материал на первом стекле распределяют на 2/3 его поверхности, на втором — в центре).
Оба препарата фиксируют троекратным проведением над пламенем горелки. Первый препарат окрашивают по Цилю — Нильсену, второй — по Граму.
Для окраски препаратов по Цилю-Нильсену необходимы следующие краски и реактивы:
Фуксин Циля: основного фуксина 1 г, глицерина 4 капли, этилового спирта 96° 10 мл, карболовой кислоты (5% раствор фенола) 5 мл, дистиллированной воды 90 мл. К фуксину, помещенному в фарфоровую ступку, прибавляют глицерин, хорошо растирают, постепенно приливают карболовую кислоту, спирт и воду. Фильтруют.
0,2 % водный раствор метиленовой синьки — 1 г метиленовой синьки растворяют в 500 мл дистиллирован- вой воды.
Техника окраски . На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги (уже и короче предметного стекла), на которую наливают в избытке фуксин Циля. Затем препарат нагревают до появления паров (достаточно троекратно медленно провести его над пламенем горелки), дают ему остыть в течение 3-5 минут, сбрасывают с помощью пинцета бумажку, промывают препарат водой и наливают на него 3% раствор солянокислого спирта для обесцвечивания на 20 секунд. После этого препарат промывают водой и вновь повторяют обесцвечивание. Материал должен быть серовато-розового цвета. Затем на препарат на 20-30 секунд наливают 1: 500 водный раствор метиленовой синьки, краску сливают, препарат промывают водой и высушивают, установив в вертикальном положении на полоску фильтровальной бумаги.
Высушенный препарат рассматривают под микроскопом с иммерсией, с поднятым конденсором.
В препарате микобактерии туберкулеза (рис. 60) красного цвета, нежные, тонкие, слегка изогнутые, иногда зернистые. Иногда обнаруживают микобактерип туберкулеза в виде так называемых осколков (в составе тетрады Эрлиха).
Рис. 60. Микобактерии туберкулеза в мокроте. 1 — окраска по Цилю-Нильсену, 2 — в люминесцентном микроскопе.
Все остальные элементы, в том числе и другие микроорганизмы, окрашены в синий цвет. С целью обнаружения мпкобактерий туберкулеза препарат тщательно исследуют, продвигая от одного продольного края к другому и поперек мазка. Во всех сомнительных случаях рекомендуют обработать препараты жавелевой водой Результат исследования оформляют, используя следующую формулировку: «микобактерип туберкулеза не обнаружены» или «микобактерип туберкулеза обнаружены», и отмечают приблизительное их количество, например, «единичные в препарате», «единичные в поле зрения» и т. д.
В настоящее время находит все большее распространение люминесцентный способ обнаружения микобактерий туберкулеза в мокроте. Микобактерип туберкулеза имеют золотисто-желтое свечение на черном фоне препарата (рис. 60, 2).
В тех случаях, когда количество микобактерий туберкулеза в мокроте незначительно, для их обнаружения применяют метод обогащения (флотация), который состоит в следующем. В бутылку с нешироким горлышком (емкостью 250 мл) помещают 12-20 мл мокроты, добавляют равный объем 0,5% раствора КОН и встряхивают 5-10 минут. Затем приливают около 10 мл дистиллированной воды и 0,5-1 мл бензина или ксилола, взбалтывают 10-15 минут и доливают дистиллированную воду гак, чтобы горлышко бутылки было заполнено. Смесь оставляют на 1-2 часа до образования на поверхности жидкости сливкообразного слоя. На два предметных стекла, заранее расположенных на мостике над водяной баней, нагретой до 60-65°, каплями, с помощью пастеровской пипетки, 5-6 раз наносят сливкообразный слой, каждый раз после подсыхания предыдущей капли. Мазки окрашивают фуксином Циля на водяной бане (без дополнительной фиксации) в течение 10 минут, промывают водой, 3-4 минуты обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта, вновь обмывают водой, докрашивают 0,2% водным раствором метиленовой синьки, высушивают и исследуют под микроскопом.
Для окраски препаратов по Граму требуются следующие краски и реактивы:
Разведенный фуксин Циля (фуксин Пфейффера): 1 часть фуксина Циля + 9 частей дистиллированной воды.
Реактив Люголя.
1 % спиртовой раствор генцианвиолета — 1 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 96° этилового спирта. Этот раствор краски можно заменить бумажкой, приготовленной по методу Синева (белую фильтровальную бумажку пропитывают 1% спиртовым раствором генцианвиолета, затем высушивают и разрезают на мелкие квадратики соответственно размеру мазка).
Техника окраски . На фиксированный препарат накладывают бумажку Синева и смачивают ее водой (при отсутствии бумажки Синева ее заменяют белой фильтровальной бумажкой, на которую наносят несколько капель 1% спиртового раствора генцианвнолета). Через 1-2 минуты бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя. Через 1-2 минуты препарат обесцвечивают 1-2 каплями 96° этилового спирта до появления бледно-серой окраски материала, смывают водой, на 10-15 секунд наносят сруксин Пфейффера, после чего вновь смывают водой и высушивают. В препаратах могут быть обнаружены (рис. 61) стафилококки, стрептококки, диплококки, палочки Пфейффера, спирохеты Плаута-Венсана, актиномицеты и другие микроорганизмы.
После проведенного исследования мокроту сжигают или обеззараживают. Последнее достигается следующими способами: а) автоклавированием в течение одного часа при 1,5 атм.; б) кипячением в течение одного часа в 1-2% растворе соды; в) обработкой 5% раствором лизола, карболовой кислоты или смесью, состоящей из равных объемов 5% раствора хлорамина и 5% раствора сернокислого аммония, в течение 12-24 часов. После обеззараживания посуду тщательно моют водой и высушивают.
Металлические предметы (шпатели, иглы) обеззараживают прокаливанием над огнем. Во избежание переноса микроорганизмов из одной порции мокроты в другую шпатель и иглу немедленно прокаливают после отбора соответствующих частиц.
Покровные стекла опускают в небольшую плоскую чашечку с 40% раствором серной кислоты на 12-24 часа. Затем кислоту сливают, а стекла неоднократно промывают водопроводной и дистиллированной водой. Вымытые стекла высушивают и используют для последующих исследований.
источник
Метод назван именами немецких медиков — микробиолога Франца Циля (1857—1926) и патологоанатома Фридриха Нельсена (1854—1898), которые разработали его в 1882—1883 гг.
Метод окраски микроорганизмов для выявления кислотоустойчивых микобактерий (возбудителей туберкулёза, микобактериозов, лепры), актиномицетов и других кислотоустойчивых микроорганизмов. Кислотоустойчивость микроорганизмов обусловлена наличием в их клетках липидов, воска и оксикислот.
Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают в течение 3 – 5 мин. раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краситель до кипения.
Окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным раствором серной кислоты в течение 3 – 5 с или 96° этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты, несколько раз погружая стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом.
После обесцвечивания остаток кислоты сливают и тщательно промывают препарат водой.
Отключите adBlock! и обновите страницу (F5) очень нужно
источник
Окраска по Цилю-Нильсену – это один из методов, используемый для обнаружения при исследовании анализов больного различных заболеваний. В случае изучения мокроты пациента на предмет наличия возбудителей, к примеру, туберкулеза широко используется данный метод. В этой статье пойдет речь о нюансах его проведения, а также о некоторых аналогичных методах.
Этот метод окрашивания используется в тех случаях, когда необходимо выявить в образце кислотоустойчивые микроорганизмы, к которым относятся возбудители туберкулеза, проказы и микробактериозов. Такие бактерии характеризуются, прежде всего, медленной скоростью роста, общими морфологическими особенностями, а также устойчивостью к кислотам и некоторым другим химическим веществам. Из-за последнего свойства такие бактерии плохо поддаются окраске обычными разведенными красителями. Для окрашивания таких бактерий на препарат наносится и в дальнейшем поджигается фуксин Циля, причем полученная окраска не исчезает под воздействием спирта и кислот.
Для проведения окраски образца по методу Циля-Нильсена необходимы следующие реактивы:
Метиленовый синий с 10%-ным содержанием спирта;
Раствор солянокислого спирта;
Фуксин Циля, состоящий из фенола, фуксина и этилового спирта в количестве 50 г, 10 г и 10 г соответственно.
Также потребуется следующие инструменты:
Газовая горелка;
Часы для слежения за временем;
Вода;
96%-ный этиловый спирт;
Перчатки.
Окрашивание по методу Циля-Нильсена состоит из следующих этапов:
На мазок, находящийся на предметном стекле, накладывается фильтровальная бумага, на которую затем наносится небольшое количество фуксина Циля.
Затем предметное стекло нагревается до появления характерного пара. После появления пара стеклу нужно дать остыть. Затем нужно повторить эту процедуру еще 2 раза, а затем дать подогретому мазку остыть.
После этого нужно смыть фуксин с приборного стекла, предварительно убрав бумагу, с помощью дистиллированной воды.
Затем стекло помещается в раствор соляной или серной кислоты до полного обесцвечивания.
Наконец, на обесцвеченный препарат наносится раствор метиленового синего. Стекло промывается дистиллированной водой и высушивается для дальнейшего исследования образца под микроскопом.
Липиды, которые содержатся в клеточной стенке кислотоустойчивых бактерий, хорошо удерживают цвет основного красителя. В некислотоустойчивых бактериях стабильно удерживается цвет как основного красителя, так и дополнительного.
При подозрениях на туберкулез исследуется мокрота больного. Длительный кашель с обильными выделениями является показанием для проведения подобного исследования. Визуально наличие возбудителей туберкулеза в организме может выдать мокрота характерной жидкой, пенистой консистенции и признаками гноя, а также мокрота, смешанная с кровью. Обнаружение возбудителей туберкулеза – рисовидных телец, известных также как линзы Коха, облегчается при использовании методов окраски образца. Таких как вышеописанный метод Циля-Нильсена или метод Грама, суть которого будет описана ниже.
Окраска препарата по методу Грама проводится следующим образом:
Сперва препарат обрабатывается раствором Люголя на протяжении минуты;
Затем препарат обесцвечивается с использованием спирта;
Наконец, препарат промывается с использованием воды и дополнительно окрашивается фуксином.
Классификацию бактерий на грамположительные и на грамотрицательные можно наглядно увидеть при проведении подобной окраски. Первый тип бактерий окрашивается в темно-фиолетовый цвет, тогда как второй тип – в красный цвет. Исходя из такой классификации, можно судить о химическом составе клеточной стенки бактерии и о других ее характерных свойствах.
Анализ мокроты пациента является жизненно необходимым для своевременного выявления заболеваний, затрагивающих дыхательные пути, в том числе и туберкулеза. Окрашивание по методу Циля-Нильсена помогает выявить микроорганизмы и возбудители подобных болезней. В том числе и в случаях, когда речь идет об атипичных бактериях. Тем самым позволяет производить более точную и качественную диагностику подобных болезней.
Если вы сталкивались с подобными заболеваниями, знакомы с техниками исследования анализов больного на предмет наличия в них возбудителей инфекции или же у вас есть вопрос по теме, вы можете оставить свой комментарий.
источник
Один из наиболее широко используемых способов диагностики туберкулёза лёгких — это окрашивание мазка мокроты по Цилю-Нильсену. В чём суть этого метода? Почему этот анализ назначают при туберкулёзе? Насколько достоверны его результаты?
Окрашивание по Цилю-Нильсену позволяет окрасить бактерии, которые устойчивы к воздействию кислот. К таким относятся возбудители туберкулёза, в том числе легочных форм, и лепры. При данной диагностической пробе их окраска получается контрастной по отношению к остальной части мазка.
Сначала подготовленный мазок обрабатывают фуксином Нильсена, нагревают на горелке. Это повторяют несколько раз, добавляя краситель. Затем излишки фуксина смывают водой и обесцвечивают мазок раствором серной кислоты. Следующий этап — окраска метиленовым синим, к которому чувствительно всё, кроме кислотоустойчивых бактерий и структур.
Для диагностики туберкулёза лёгких используют различные методы исследования мокроты, которая выделяется при кашле у пациентов с этой патологией. Этот способ диагностики позволяет дифференцировать болезнь и подтвердить факт выделения микобактерий в окружающую среду.
Это далеко не единственная методика, но она используется практически во всех лабораториях, где происходит определение микобактерий. Обычно анализ проводят перед началом противотуберкулёзной терапии и несколько раз во время лечения.
Для наиболее точного результата первый забор материал для исследования должен происходить до начала приёма медикаментов, контейнеры для мокроты можно брать только стерильные. Также крайне нежелательно, чтобы между моментом забора материала и его исследованием прошло более часа, особенно летом.
Необходимо следить за тем, чтобы мокрота как можно меньше контактировала с ротовой полостью. В таком случае результат может получиться искаженным. Перед окраской по Цилю-Нильсену проводится обработка диагностического мазка по Грамму. Если количество лейкоцитов и эпителиальных клеток высокое, что является признаком того, что мокрота из носоглотки, а не нижних дыхательных путей, стоит повторить забор материала.
При окраске по методике Циля-Нильсена микобактерии туберкулёза окрашиваются контрастно по отношению к остальной части мазка.
Признаки положительного результата:
Длина, интенсивность, толщина палочек немного зависит от их возраста (растущие или взрослые формы) и метода выделения (выращенная на питательной среде, от больного до или после терапии).
Но в любом случае внешний вид микобактерий достаточно специфичен, что сводит к минимуму вероятность ложного положительного результата.
Основным минусом диагностики туберкулёза лёгких окраской по Цилю-Нильсену является то, что при начальных стадиях болезни в мокроте содержится слишком маленькое для обнаружения количество микобактерий или они вообще не выделяются.
Исследование проходит очень быстро, результаты готовы через несколько часов после сдачи диагностического материала.
Используются доступные для большинства лабораторий реактивы.
Метод даёт возможность сделать вывод о том, выделяется ли палочка наружу, то есть определить степень заразности (открытая или закрытая форма туберкулёза).
Помогает быстро и недорого диагностировать тяжелые формы с неблагоприятным прогнозом.
Материал для исследования можно взять быстро и безболезненно и у взрослых, и у детей, кроме самых маленьких.
Проведение нескольких проб у одного пациента повышает вероятность выявления микобактерий в мазке, если он болен. Результат считается позитивным, даже если палочка туберкулёза была обнаружена только в одном из 3 исследований. В сомнительных ситуациях назначаются дополнительные анализы.
источник
При исследовании мазков по Цилю-Нельсону следует избегать:
1. приготовления толстых мазков мокроты;
2. фиксации плохо высушенных мазков;
3. недостаточной фиксации;
4. обжигания препарата при длительной фиксации.
Эта методика должна выполнятся в условиях клинических лабораторий, начиная с уровня поликлиники, входит в поликлинический и клинический минимум обследования пациента, страдающего кашлем с мокротой (трехкратное микроскопическое исследование мокроты на микобактерии туберкулеза). Бактериоскопия мокроты должна проводится и больным хроническими заболеваниями органов дыхания и мочевыводящих путей, а также работникам неблагоприятных по туберкулезу животноводческих хозяйств. При обнаружении в мазке в одном поле зрения пяти и более микобактерии вероятность получения положительного результата посева материала на питательные среды значительно возрастает. Метод микроскопического исследования кислотоустойчивых мазков с окраской по Цилю-Нильсону позволяет быстро получить результаты, но обладает низкой чувствительностью и специфичностью. Частота выявлений микобактерии у больных туберкулезом при микроскопии мокроты составляет по данным разных авторов от 48 до 78%. При этом сравнение данных микроскопических исследований с данными культуральных исследований показывает, что доля ложноположительных результатов составляет до 6%.
Приготовление растворов для метода по Цилю-Нильсону:
Раствор 1. Насыщенный спиртовый раствор фуксина (3%) — растереть в ступке 0,3 г основного фуксина с 2-3 каплями глицерина, добавить по каплям 10 мл 96 ? этилового спирта. Добиться полного растворения фуксина.
Раствор 2. Рабочий раствор фенола (5% водный раствор) — расплавить 5 г кристаллического фенола на водяной бане или в термостате (температура плавления фенола 41 ? С).
Осторожно! При попадании фенола на кожу вызывает ожоги. Растворить расплавленный фенол в 100 мл воды.
Рабочий раствор 3. Рабочий раствор карболового фуксина — в 90 мл полученного раствора фенола (раствор №2) добавить 10 мл насыщенного раствора фуксина (раствор №1).
Раствор 4. Обесцвечивающий раствор серной кислоты (25%) — к 75 мл дистиллированной воды осторожно долить 25 мл концентрированной серной кислоты, постепенно наслаивая ее по стенкам сосуда, смешать. Содержимое нагреется.
Всегда медленно добавляйте кислоту в спирт, а не наоборот! Смесь может нагреться.
Раствор 5. 0,3% раствор метиленового синего — растворить 0,3 г хлорида метиленового синего в 100 мл дистиллированной воды.
Переходные материалы и реактивы
Предметные стекла; 25х75 мм; 1,1-1,3 мм толщиной (на 1 год).
Восковые карандаши или алмазные ручки или несмываемые водой фломастеры.
Фильтровальная бумага, фильтры диаметром 15 см №1.
Шариковая ручка черная или синяя.
Петля бактериологическая, нихромовая, 1 мм диаметром.
Спирт этиловый 96%, х.4 (для приготовления спиртового фуксина).
Реактивы для обесцвечивания:
— серная кислота, 96% х.4, или
— солянокислый спирт 3%
— соляная кислота, концентрированная, х.4
— спирт этиловый, 96%, х.4
Спирт этиловый технический.
Учет результатов микроскопического исследования
Количество КУМ являет очень важным информационным показателем, так как оно характеризует степень эпидемиологической опасности больного и тяжесть заболевания. Поэтому микроскопическое исследования должно быть не только качественным, но и количественным. При использовании объектива 90х или 100х окуляра 7х10 (общее увеличение равно 630х 1000х) используется следующая градация результатов световой иммерсионной микроскопии.
Градация результатов микроскопического исследования
источник
Микобактериозы – группа инфекционных заболеваний человека и животных, включая все виды птиц, вызываемая бактериями рода Mycobacterium.
Хронический дерматит у попугая (Amazon spp.), вызванный Mycobacterium kansasii. источник: «Avian and Exotic Animal Dermatology» Cheryl Greenacre
Большинство видов микобактерий птиц вызывают хроническую (зачастую без проявления внешней симптоматики в течение длительного периода времени) полиорганную инфекцию с поражением печени, селезенки, легких, кишечника, суставной и костной ткани.
Также процесс может протекать локально, с поражением отдельных участков кожи и прилежащих тканей (чаще в области головы либо конечностей).
Некоторые виды возбудителя являются зооантропонозными, т.е.заразны для животных и человека. К ним относятся в том числе Mycobacterium tuberculosis, M.bovis и M.avium, вызывающие у людей туберкулёз. Передача возбудителя может происходить от птицы человеку и наоборот – в равной степени и люди, болеющие туберкулёзом, несут опасность заражения для домашних птиц, проживающих с ними.
Помимо трех вышеобозначенных видов, есть и другие микобактерии (M.fortuitum, M. scrofulaceum, M. intracellulare и др.), встречающиеся у птиц и потенциально опасные для людей. Чаще они не вызывают системных поражений (тубёркулеза), однако могут провоцировать очаговые хронические дерматиты с образованием абсцессов; главным образом, к группе риска по подобным атипичным микобактериозам относятся дети младшего возраста, пожилые люди, ВИЧ-положительные, онко-больные, а также люди, проходящие химиотерапию или иммуносупрессивную терапию.
Проблема постановки диагноза на микобактериоз и лабораторной диагностики данного заболевания у птиц стоит весьма остро, и на то есть несколько причин:
1. неравномерное выделение возбудителя из организма больного животного – не каждая проба помета может нести в себе микобактерии или содержать достаточное их количество для диагностики. Отсюда вытекает две сопутствующие проблемы: 1.1 необходимость проведения серий анализов – окраска по Цилю-Нильсену, ПЦР, посевы на питательные среды– для постановки окончательного диагноза; 1.2 зачастую требуется концентрация микобактерий в материале(методом флотации) перед проведением анализа, что в разы повышает эффективность обнаружения возбудителя при любом методе диагностики (окраске, ПЦР, посевах).
Микроскопия окрашенной по методу Циля-Нильсена мокроты человека, больного туберкулезом: справа на фото материал после концентрации (источник: статья «Методы окраски микроорганизмов» probakterii.ru )
2. необходимость концентрации материала приводит к последующей сложности: соответствующее оснащение лабораторий для безопасной работы с концентрированным зооантропонозным возбудителем в материале для проведения анализов. Именно за счёт повышенного риска для сотрудников при работе с концентрированными пробами единицы лабораторий (как правило, это государственные лаборатории на базе НИИ) ведут данную деятельность.
Выдержка из статьи «Туберкулез – профессиональное заболевание у медицинских работников» В.В.Косарев, С.А.Бабанов: «По степени риска заражения туберкулезом медицинские работники распределяются следующим образом: на первом месте — персонал бактериологических лабораторий (контакт с больными туберкулезом и живой патогенной культурой); затем — работники стационаров противотуберкулезных учреждений (контакт с больными с лекарственной устойчивостью микобактерий, что подтверждает внутрибольничный путь заражения); … распространенность латентной туберкулезной инфекции крайне высока среди медицинских работников (31,3 %), в особенности среди сотрудников противотуберкулезной службы (49,3 %)…»
[немаловажно: риск заражения владельца прямо пропорционален длительности его проживания с зараженной птицей, т.к.птица-бактериовыделитель способствует поддержанию высокой, нарастающей концентрации микобактерий в помещении, особенно при отсутствии регулярной уборки со специфическими дез.средствами, т.к.микобактерии являются кислото-, спирто-, щёлоче-устойчивыми микроорганизмами, длительно сохраняющимися в окружающей среде]
Для диагностики микобактериозов у содержащихся в неволе птиц в России доступны следующие методы:
Материал: помет, мокрота, мазки со слизистых оболочек и из очагов поражения кожи, синовиальная и перитонеальная жидкость, мазки-отпечатки органов при посмертной диагностике.
Принцип метода основан на обнаружении микобактерий при микроскопии материала – в готовом мазке они окрашены в красный цвет красителем фуксином Циля, т.к.являются кислотоустойчивыми, большинство же других микроорганизмов обесцвечивается (на этапе промывания мазка серной кислотой после фуксина) и затем окрашивается в синий (на этапе завершающей окраски метиленовой синью).
Преимущества:
Недостатки:
экспресс-метод, быстрое получение результата;
доступность расходных средств и простота выполнения;
относительно высокая чувствительность метода даже при работе без концентрации материала.
невозможность определения типа обнаруженных микобактерий;
необходима последующая диагностика (ПЦР, посевы) для исключения зооантропонозных видов возбудителя.
Окрашенные по методу Циля-Нильсена помёт жако – слева (более 40 микобактерий в поле зрения микроскопа), помёт сизого голубя – по центру (единичные микобактерии в поле зрения), помёт кореллы – справа (более 100 микобактерий в поле зрения). Фото автора.
При последующей сдаче помёта от данных пациентов на ПЦР-диагностику только от жако с первого же раза была получена положительная ПЦР и подтвержден возбудитель M.bovis. Две другие птицы прореагировали ложно-отрицательно. Корелла прореагировала положительно при повторной ПЦР по помёту. Голубь прореагировал ложно-отрицательно при повторной ПЦР по помёту, но диагноз был подтвержден по ПЦР крови.
Материал: кровь, помет, мокрота, мазки со слизистых оболочек и из очагов поражения кожи, синовиальная и перитонеальная жидкость, кусочки органов при посмертной диагностике.
Преимущества:
Недостатки:
экспресс-метод, быстрое получение результата;
возможность определения типа обнаруженных микобактерий при проведении ПЦР на конкретные виды возбудителя: на данный момент в России это возможно для основных зооантропонозных возбудителей – M.tuberculosis, M.bovis, M.avium.
условно метод ПЦР-диагностики считается высокочувствительным, на практике же ложно-отрицательные результаты при малом количестве возбудителя в пробе – частое явление, посему требуется серия анализов в нескольких лабораториях;
низкая доступность расходных средств и необходимость соответствующего оснащения лаборатории для работы с ПЦР.
Материал: помет, мокрота, мазки со слизистых оболочек и из очагов поражения кожи, синовиальная и перитонеальная жидкость, кусочки органов при посмертной диагностике.
Метод основан на культивировании (высевании) бактерий из материала на специальных питательных средах (наиболее часто используемой является среда Левенштейна-Йенсена), с целью обнаружения роста возбудителя и дальнейшего получения чистой культуры микобактерий для проведения последующей типизации.
Преимущества:
Недостатки:
возможность определения типа высеенных микобактерий на основнии морфологических и культуральных свойств полученного возбудителя;
относительно высокая чувствительность метода даже при работе без концентрации материала.
длительность проведения анализа – вплоть до 2-3 месяцев, т.к.микобактерии являются медленнорастущими микроорганизмами;
необходимость соответствующего оснащения лаборатории для безопасной работы с чистой культурой возбудителя.
Метод основан на выявлении местной аллергической реакции на введение птице внутрикожно туберкулина (готовится из очищенной убитой культуры микобактерий) – положительная реакция обуславливается специфическим иммунным ответом со стороны организма, т.е.свидетельствует об активном взаимодействии возбудителя микобактерий с организмом птицы.
Преимущества:
Недостатки:
быстрое получение результата (учёт реакции проводится через 24, 48,72 часа после постановки внутрикожной пробы);
при положительной реакции точно известен тип возбудителя – M.avium.
метод часто дает ложноотрицательный результат, т.к.туберкулин птиц готовится конкретно из культуры Mycobacterium avium, соответственно, специфическая аллергическая реакция будет установлена только для птиц, зараженных типом M.avium;
низкая доступность туберкулина птиц в продаже;
необходимость наблюдения птицы ветеринарным врачом в течение 3х суток для объективной оценки реакции.
Таким образом, выборочное использование только одного из представленных выше методов для постановки или опровержения окончательного диагноза на микобактериоз у птиц не является объективным.
Необходимо также учитывать, что даже единоразовое получение от обследуемого животного любого положительного результата при любом методе диагностики, является прямым показанием к рассмотрению птицы как подозрительной по микобактериозу, т.е.требующей системного разностороннего подхода к лабораторной диагностике и отбора серии проб в первую очередь для исключения опасности зоонатропонозной инфекции для владельца.
заглавное фото: фрагмент картины Louis Edouard Dubufe
источник
В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию кислот, щелочей и спиртов. Они относятся к роду Mycobacterium(возбудители туберкулеза, паратуберкулеза крупного рогатого скота, проказы человека). Химическая структура цитоплазмы и клеточной оболочки микроорганизмов данной группы отличается содержанием значительного количества жировосковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому проникновение красителя в клетку затруднено. Для их окраски используют протравливание (нагревание мазка с красителем над пламенем). Окрасившись, они прочно удерживают краску и не обесцвечиваются кратковременным действием кислоты.
1. Фиксированный на пламени мазок покрывают полоской фильтровальной бумаги, наливают на нее карболовый раствор фуксина и подогревают; при появлении паров прекращают нагревание и оставляют краску на препарате еще на несколько минут (2—3 минуты). Дав препарату остыть, удаляют пинцетом бумажку и обмывают мазок водой.
2. Обесцвечивают препарат 5—10% водным раствором серной кислоты в течение 3—5 секунд (до желтоватого оттенка мазка). Вместо серной кислоты можно применить 5% раствор азотной или 3% раствор соляной кислоты.
Мазок тщательно промывают водой.
6. Докрашивают в течение 3—5 минут леффлеровской метиленовой синькой или водным раствором 1: 1000 малахитовой зелени или метиловой зелени.
7. Краску смывают водой и препарат высушивают.
Микроскопическая картина: туберкулезные палочки — рубиново красные, остальные, за исключением возбудителя паратуберкулеза, кислото — и спиртоустойчивых сапрофитов, — синие. Для обесцвечивания мазков при окраске по Циль-Нильсену вместо растворов кислот и спирта особо рекомендуется применение солянокислого алкоголя (соляной кислоты 3 мл+96° спирта 97 мл) до слабо заметного розоватого оттенка препарата. После этого мазок ополаскивают водой и докрашивают метиленовой синькой и т. д. по основной прописи. Указанным методом достигается одновременное испытание бацилл на кислото — и спиртоустойчивость. Среди видов кислотоустойчивых сапрофитов встречаются спиртоподатливые разновидности, палочки же туберкулеза и паратуберкулеза всегда кислото — и спиртоустойчивы.
Занятие 4. Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий. Определение подвижности микроорганизмов.
Цель занятия.Усвоить методы окраски спорообразующих, капсулообразующих бактерий, а также определение подвижности бактерий.
Материалы и оборудование. Взвеси бактерий с вакцинным штаммом сибирской язвы, клостридиями, готовые препараты с капсулообразующими бактериями, подвижные бульонные культуры эшерихий 18 часового роста, предметные и покровные стекла, плакаты, 2% раствор сафранина, водный раствор малахитовой зелени, карболовый фуксин Циля.
Методические указания. Каждый студент готовит мазки из взвесей микроорганизмов и окрашивает их по методу Трухильо, Ольта, микроскопирует и зарисовывает; готовит препарат для изучения подвижности микроорганизмов методом «раздавленная» и «висячая» капля.
Окраска спор. При неблагоприятных условиях для микробов (отсутствие питательной среды, высушивание, неблагоприятная температура и др.) в цитоплазме некоторых микроорганизмов образуются споры. Формируются они внутри вегетативной клетки, являясь эндоспорами. Палочковидные грамположительные микроорганизмы, образующие округлые споры, диаметр которых не превышает ширину микробной клетки, относятся к родуBacillusи называются бациллами. Микроорганизмы родаClostridiumимеют споры диаметр которых превышает ширину микробной клетки и называются клостридиями. По форме они бывают овальные и круглые (рис. 5).
Споры устойчивы к воздействию высоких температур, химических веществ, к высыханию, длительно сохраняются в почве, что объясняется их особым строением и химическим составом, в особенности ее оболочки. Поэтому споры стойки к действию красителей.
Все методы окраски спор основаны на обеспечении проникновения красителя через трудноокрашиваемую оболочку споры. Поэтому применяют протраву. После охлаждения оболочка вновь становится плотной и не пропускает дополнительный краситель.
Техника окраски спор методом Трухильо. На фиксированный мазок накладывают небольшой кусочек фильтровальной бумаги и на нее наносят водный раствор малахитовой зелени.
Рис. 5. Споры микроорганизмов различных типов
Подогревают препарат на пламени горелки до появления паров и выдерживают в течение 3 минут, промывают водой и докрашивают 0,25%-ным водным раствором основного фуксина 1 минуту. Промывают водой и высушивают. Микрокартина: споры зеленые, а вегетативные клетки красные.
Окраска капсул. Тело микробной клетки покрыто рыхлым слизистым слоем. У некоторых видов микроорганизмов этот слой развивается очень сильно и тогда он называется капсулой. Капсула — муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид, является производным наружного слоя оболочки. Наличие капсулы является важным диагностическим признаком при идентификации и дифференциации возбудителей некоторых инфекций (сибирской язвы, пневмококковой пневмонии и др.) (рис. 6). Патогенные микроорганизмы образуют капсулу в инфицированном организме. Она является фактором вирулентности и защищает бактериальную клетку от фагоцитоза и бактерицидного действия сыворотки крови. Капсульное вещество плохо окрашивается. Поэтому при приготовлении препарата для обнаружения капсулы выполняют следующие правила:
а) мазок готовят из свежего материала, так как капсула быстро лизируется;
б) фиксируют мазок химическим способом, для окраски применяют метохромотические краски, то есть при использовании, которых цитоплазма окрашивается в один цвет, а капсула — в другой;
в) промывать мазок водой следует слабо и кратковременно.
Техника окраска капсул по методу Ольта. Свежий горячий 2%-ный раствор сафранина наносят на фиксированный мазок, окрашивают 5-7 минут. Быстро промывают водой и высушивают. Тело клетки окрашивается в краснокирпичный цвет, капсула в — желто-оранжевый. Определение подвижности бактерий.
Подвижности бактерий важный видовой признак и производиться при диагностических исследованиях: результат учитывают при идентификации микроорганизмов. У подвижных видов способность самостоятельного поступательного (и вращательного) движения обусловлена наличием жгутиков— специальных тонких нитевидных образований.
Рис.6.Капсула у бактерий а ‑ бацилла сибирской язвы; б — диплококк
Жгутики бывают различной длины.
Их диаметр настолько мал, что они невидимы в световом микроскопе (менее 0,2 мкм). У разных групп бактерий количество и расположение жгутиков неодинаково. Жгутики плохо воспринимают красители. Методы сложной окраски искажают подлинный вид жгутиков, поэтому в лабораториях окраску жгутиков не осуществляют, а исследуют бактерии в живом состоянии. В зависимости от расположения и количества жгутиков микробы подразделяют (рис. 7):
а) монотрихи — микроорганизмы, имеющие на одном из полюсов один жгутик, движения активные, поступательные (псевдомонас);
Рис. 7. Типы расположения жгутиков у бактерий
б) лофотрихи— микробы, имеющие на одном из полюсов пучок жгутиков (листерии);
в) амфитрихи— микробы, имеющие жгутики на обоих полюсах микробной клетки;
г) перитрихи — микробы, у которых жгутики расположены по всей поверхности клетки(E.coli).
Есть виды микроорганизмов, обладающие подвижностью, но жгутиков не имеют (спирохеты, лептоспиры). Их движение обусловлено импульсивными сокращениями двигательного фибриллярного аппарата микробной клетки.
Для определения подвижности у бактерий необходимо использовать культуру не старше суточного возраста, так как старые культуры утрачивают способность передвигаться.
Определение подвижности бактерий методом «висячая капля». Каплю молодой (18-20 часовой) бульонной культуры бактерий бактериологической петлей наносят на покровное стекло. Специальным предметным стеклом с углублением (луночкой) накрывают каплю культуры так, чтобы покровное стекло с каплей находилось в центре луночки и прилипло к предметному стеклу (края луночки предварительно слегка смазывают вазелином). Препарат перевертывают стеклом вверх, и капля «повисает» над луночкой (рис. 8). Препарат микроскопируют при затемненном поле зрения, сначала при малом, затем при среднем или большом увеличении. На светлом фоне микробы темно-серые. Методом Шукевича. Для этого каплю микробной взвеси наносят в конденсат скошенной плотной питательной среды в пробирке. Подвижные микроорганизмы, передвигаясь из конденсата, растут на поверхности среды; неподвижные виды размножаются только в конденсате среды («не заходя» на поверхность агара).
Рис. 8. Исследование микробов на подвижность а ‑ стекло с луночкой; б ‑ «висячая капля»
Метод «раздавленная капля». Каплю бактериальной взвеси наносят на обычное предметное стекло, осторожно накрывают покровным стеклом и слегка придавливают пальцем. Микроскопию проводят, так же как и в методе «висячая капля».
Метод посева уколом в полужидкий агар. Для этого бактериологической петлей производят посев исследуемой культуры уколом до дна пробирки с полужидкой питательной средой. Подвижная культура растет по всей питательной среде, образуя равномерное помутнение, а неподвижная — только по уколу в виде стержня, сохраняя прозрачность незасеянного участка среды.
ЗАНЯТИЕ 5. Лабораторная посуда и её подготовка. Питательные среды. Методы приготовления и стерилизации питательных сред. Методы стерилизации лабораторной посуды.
Цель занятия. Подготовить посуду. Приготовить питательные среды. Определить рН сред. Ознакомиться с методами стерилизации питательных сред и лабораторной посуды.
Оборудование и материалы.Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки, чашки Петри, бумага. Автоклав, сушильный шкаф. Набор сред и химических реактивов. рН -метр.
источник
Консультант по гематологии,
цитохимии и микробиологии
Важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях занимают микробиологические исследования. Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.
Материалом для изучения этиологии заболеваний дыхательных путей служат: отделяемое зева и носа; мокрота; содержимое бронхов, полученное при бронхоскопии или при отсасывании через трахеостому (у больных, находящихся на аппаратном дыхании); экссудаты; резецированные ткани и др. Материал собирают с соблюдением правил асептики в предварительно простерилизованные баночки или пробирки и доставляют в лабораторию. Хранение материала способствует размножению сапрофитирующей микрофлоры, развитию процессов гниения и брожения, что искажает результаты анализа. Интервал между взятием материала и его посевом не должен превышать 1-2 часа. Самым простым методом выявления микобактерий туберкулеза в выделениях больных является микроскопия мазка, приготовленного из мокроты. При бактериоскопии мазка, окрашенного по Цилю-Нильсену, микобактерии туберкулеза могут быть обнаружены при наличии не менее 100 000 — 1 000 000 бактериальных клеток в 1 мл патологического материала (мокроты). Такое большое количество микобактерий встречается у больных с далеко зашедшими прогрессирующими формами заболевания (диссеминированными и фиброзно-кавернозными). У значительно большего числа больных количество выделяемых ими микобактерий ниже предела метода бактериоскопии.
Чувствительность метода люминесцентной микроскопии значительно выше — от 10 000 до 100 000 микобактерий в 1 мл материала, кроме того, этот метод дает возможность за значительно более короткое время просмотреть необходимое количество препаратов. Эффективность бактериоскопии повышается также при передаче изображения на компьютер при помощи присоединенной к микроскопу видеокамеры.
Чтобы диагностировать туберкулез, необходимо сделать все возможное для выявления возбудителя заболевания. Микробиологически диагноз может быть подтвержден на основе результатов культурального исследования на комплекс M. tuberculosis (или, при возможности, путем идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот) в пробах, взятых в месте локализации патологического процесса. Однако на практике в настоящее время многие лаборатории не располагают материально-технической базой для проведения культуральных исследований. К счастью, микроскопия окрашенных препаратов мокроты доступна практически везде, поэтому диагностика туберкулеза может проводиться на основе выявления кислотоустойчивых микобактерий. На территориях с высокой распространенностью туберкулеза выявление кислотоустойчивых микобактерий в окрашенных препаратах мокроты демонстрирует высокую специфичность, поэтому положительный результат микроскопии мокроты можно рассматривать как подтверждение диагноза. Кроме высокой специфичности к комплексу M. tuberculosis, выявление кислотоустойчивых микобактерий при микроскопии играет важную роль по трем причинам: это – наиболее быстрый метод диагностики туберкулеза; позволяет выявить больных с тяжелым развитием патологии, чреватым высоким риском летального исхода; дает возможность выявить больных, являющихся распространителями инфекции.
Оценка качества работы лабораторий микроскопии должна проводиться соответствующим государственными органом (как правило, представителями национальной программы борьбы с туберкулезом).
Неправильный диагноз, поставленный перед началом лечения, приводит к риску ненужного, неправильного или неудачного лечения. Более того, подобный подход чреват несвоевременной постановкой правильного диагноза и назначением соответствующего лечения. При надлежащем подходе и контроле в большинстве случаев у детей в возрасте пяти лет и старше могут быть получены образцы мокроты. У подростков (хотя они часто относятся к детской возрастной группе, по крайней мере, до 15 лет) получить пробы мокроты не составляет большого труда. Поэтому фактор возраста не может рассматриваться как препятствие для сбора проб мокроты у детей и подростков.
Исходя из имеющихся данных, можно прийти к заключению, что для диагностики туберкулеза необходимо взять не менее двух проб мокроты. В случаях, когда имеются соответствующие возможности, можно направлять для лабораторного исследования еще и третью пробу, но исследование более трех проб мокроты вряд ли целесообразно, поскольку не может в значительной мере повысить эффективность диагностики. Кроме того, исследование третьей пробы может оказаться полезным только для подтверждения диагноза, если одна или две предыдущие пробы дали положительный результат. Крайне желательно, чтобы результаты микроскопии мокроты направлялись лечащему врачу в течение одного рабочего дня с момента отправки проб. Не меньшее значение имеет также и время сбора проб. Результаты исследований показывают, что эффективность лабораторных анализов максимальна, если пробы мокроты получены утром, после пробуждения от ночного сна. Возможно, совершенно необязательно собирать только утренние пробы, но, про крайней мере, одна из них должна быть получена утром.
Как правило, внелегочные очаги туберкулезного процесса содержат гораздо меньшее количество M. tuberculosis, поэтому микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий в пробах из внелегочных очагов весьма затруднено, и в таких случаях результаты культуральных исследований приобретают большое значение. Учитывая низкую результативность микроскопии, при внелегочном туберкулезе культуральные и морфологические исследования приобретают особое значение, например, в диагностическом исследовании проб ткани лимфатических узлов, полученных при помощи игловой биопсии.
Лечение пациентов, у которых наблюдаются тяжелое или быстро развивающееся заболевания, ассоциированные с туберкулезом, необходимо начинать немедленно, даже до лабораторного подтверждения диагноза. Лечение следует начинать до получения результатов лабораторного исследования и лишь позднее внести необходимые поправки и изменения в схему лечения с учетом результатов микроскопии.
Хотя микроскопия мокроты является наиболее доступным бактериологическим тестом, там, где ресурсы позволяют и имеются условия для качественной лабораторной диагностики, в диагностический алгоритм необходимо включать культуральные исследования мокроты, в случаях отрицательных результатов микроскопии. Правильное проведение культуральных исследований связано с определенными трудностями и дополнительными затратами, но этот метод отличается более высокой чувствительностью и повышает вероятность раннего выявления больных туберкулезом.
Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену является важнейшим элементом диагностики туберкулеза. Исследование 3 мазков мокроты позволяет выявить более 60% случаев туберкулеза легких и 95% наиболее заразных случаев (исследование одного мазка мокроты выявляет 75% наиболее заразных случаев, исследование второго мазка мокроты добавляет еще 20%, а исследование третьего — еще 5%).
Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену позволяет быстро получить результаты, выявить основные источники инфекции, является менее дорогостоящей, чем посев мокроты и широко доступна для применения. Но она должна быть надежной и хорошо контролироваться. Вероятность обнаружения МБТ при бактериоскопии мазков мокроты прямо пропорциональна концентрации возбудителя в исследуемом материале. Например, когда в 1 мл мокроты содержится от 1000 до 10000 МБТ, то вероятность получения положительного результата составляет около 40-50%. При концентрации МБТ менее 1000 в 1 мл мокроты вероятность их обнаружения резко снижается – отрицательные результаты получаются примерно в 96% случаев.
Основным и наиболее часто изучаемым биоматериалом в пульмонологической практике является мокрота. Требования к забору и качеству мокроты следующие: 1) первую пробу мокроты желательно получить до начала курса антибиотикотерапии; 2) мокроту оптимально собирать утром, до приема пищи, после тщательного туалета полости рта (полоскание кипяченой водой); 3) больным нужно доступно объяснить, что требуется получить именно содержимое нижних отделов дыхательных путей, а не ротоглотки, и, по возможности, проконтролировать их действия; 4) забор материала проводить в стерильные интактные контейнеры; 5) продолжительность хранения мокроты в контейнерах не должна превышать 2 ч (в летнее время желательно не более 1 ч); 6) в условиях лаборатории качество мокроты оценивается после окрашивания мазка по Граму (при наличии в мазке менее 25 лейкоцитов и более 10 эпителиальных клеток, при просмотре не менее 8-10 полей зрения при малом увеличении, мокрота признается некачественной, дальнейшее ее исследование нецелесообразно, так как, скорее всего, материал получен из ротовой полости); 7) высокая диагностическая ценность исследования признается при выделении возбудителя в концентрации і106 КОЕ/мл.
Вообще, в диагностике заболеваний туберкулезом можно выделить несколько этапов:
· Преаналитический этап (предварительный диагноз, выбор материала и метода исследования, забор биомтериала и его транспортировка)
· Аналитический этап (непосредственно проведение анализа)
· Постаналитический этап (оценка результатов)
Часть этих этапов проводится вне лаборатории, поэтому очень важна согласованная и качественная работа всех специалистов, привлеченных в этот процесс. Важен правильный выбор исследуемого материала. Важным этапом диагностики являются процедуры взятия и доставки материала в лабораторию.При взятии всех видов исследуемого материала следует ориентироваться на стандартные системы для этой цели: тампоны, цитощетки, тубсеры, контейнеры и т.п. Эффективность аналитического этапа во многом определяется уровнем технического оснащения лабораторий. Постаналитический этап исследования включает две составляющие: проверку достоверности полученного результата и оценку этиологической значимости выделенных штаммов. В лаборатории должен осуществляться строгий внутренний контроль качества исследований, важной составляющей которого является проверка полученных результатов на достоверность. Оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов принципиальна для выбора адекватной терапии. Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси для обезжиривания предметных стекол (производство АБРИС+) стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем промывают в проточной воде и протирают насухо.
Для обезжиривания вымытые и высушенные стекла помещают в герметически закрытые емкости со смесью для обезжиривания. Стекла должны подвергаться обезжириванию в течение суток. Непосредственно перед приготовлением мазков стекла повторно протираются насухо. Для окраски мазков, приготовленных непосредственно из диагностического материала (метод прямой микроскопии), наиболее часто используется метод Ziehl-Neelsen (Циль-Нильсен) (Реагенты — «Диахим» — набор для окраски по Циль-Нильсену»)..
| 7358 — 
или читать все. 
Хронический дерматит у попугая (Amazon spp.), вызванный Mycobacterium kansasii. источник: «Avian and Exotic Animal Dermatology» Cheryl Greenacre 
Рис. 5. Споры микроорганизмов различных типов