Полимеразная цепная реакция пцр диагностика туберкулеза

Полимеразная цепная реакция (далее ПЦР) — это высокоточный метод молекулярно-генетического исследования материла, который позволяет выявить у человека различные инфекционные заболевания и установить генотип возбудителя.

ПЦР для выявления различных заболеваний стала применяться в самом конце прошлого века. Первооткрывателем этого метода исследования является американский биохимик Кэри Муллис. Свое открытие он сделал в 1983 году. Но еще несколько лет понадобилось, чтобы доработать метод.

С помощью ПЦР-диагностики можно обнаружить фрагменты чужеродного ДНК в любой жидкой среде организма. На анализ могут быть взяты такие жидкости:

Кровь.
Слюна.
Мокрота.
Выделения из половых органов.
Смывная жидкость бронхов.
Желудочный сок.

Лечащий врач сам определяет, какую биологическую жидкость лучше взять на анализ при конкретном заболевании.

ПЦР-диагностика позволяет не только обнаружить микрофрагменты чужеродной ДНК, но и определить к какому конкретному виду она относится. То есть с помощью ПЦР можно не только точно установить возбудителя заболевания, но и выяснить к какому виду он принадлежит.

Процесс анализа ПЦР — очень сложный. Он состоит из нескольких этапов:

Сначала нужно обнаружить фрагменты вредоносной ДНК в предоставленном образце.
Копирование фрагмента ДНК. Маленького участка ДНК для анализа недостаточно, поэтому его копируют. Нуклеиновая кислота может копироваться в пробирке с помощью фермента полимеразы (вне живого организма). В пробирке образуется множество клонов, то есть происходит цепная реакция. Весь процесс происходит в три этапа под воздействием различных температур.
Когда генетического материала становится достаточно для исследования, тогда возбудитель определяется обычными методами.

Метод ПЦР очень точен и может выявить наличие любого возбудителя по небольшому фрагменту ДНК или РНК.

ПЦР-анализ на туберкулез является самым информативным методом диагностирования этого заболевания. Относительно туберкулеза этот метод позволяет не только установить наличие микобактерий в организме, но и определить к какому виду они принадлежат.

Результат ПЦР диагностики может быть простой и расширенный. В простом результате указывается только наличие/отсутствие микобактерии. Расширенный результат дает представление о дополнительных параметрах протекания заболевания. Правильно понять, что написано в результате анализа ПЦР может только фтизиатр.

ПЦР-диагностика туберкулеза не проводится всем без исключения. Это объясняется дороговизной реактивов и недоступностью проведения исследования в некоторых отдалённых районах (в таких местах пользуются другими методами диагностики).

Показаниями для проведения ПЦР-исследования являются:

Длительный контакт с больным туберкулезом.
Беременность. ПЦР крови на туберкулез является самым быстрым и безопасным методом для беременной женщины.
Экстренная ситуация. Например, необходимость срочного оперативного вмешательства, при котором нужно точно установить наличие/отсутствие туберкулеза в организме.
Аллергическая реакция на туберкулиновые пробы.
ВИЧ-инфекция.
Невозможность диагностирования заболевания другими способами, при наличии явных признаков туберкулеза.
Неоднозначные симптомы, которые не позволяют создать четкую клиническую картину заболевания (болезни верхних дыхательных путей, сопровождающиеся большим количеством мокроты, кровохарканьем и пр.).

Метод ПЦР, при всей своей сложности и дороговизне, проводится и расшифровывается в течение нескольких часов. Что делает этот метод золотым стандартом при диагностике туберкулезной инфекции.

Забор материала — это первый этап при выполнении ПЦР-исследования. Для того, чтобы выполнить качественный анализ, нужно соблюдать определенные правила по сбору материла:

Для ПЦР мокроты на туберкулез нужно тщательно провести туалет полости рта. Делать это нужно вечером и утром перед анализом. Все это время не есть. Вечером выпить муколитическое средство для лучшего отхождения мокроты.
Перед сдачей крови на ПЦР нужно не употреблять пищу в течение 8 часов. Лучше всего производить забор крови утором натощак. Курить перед забором крови также нельзя. Кровь берется из вены на локтевом сгибе руки в стерильную пробирку. В эту же емкость добавляется антикоагулянт, чтобы кровь оставалась жидкой. Смешивать антикоагулянт с кровью нужно очень аккуратно, не делая резких движений. Если кровь была взята не в лабораторных условиях, то она должна быть предоставлена лаборанту до истечения пятичасового срока. Иначе результат может быть не точным.
Моча собирается в стерильную емкость утром, до приема пищи. Перед сбором мочи необходим тщательный туалет промежности.
Остальные виды жидкостей (смывы с бронхов, спинномозговая жидкость) может собрать только специалист в условиях стационара.
Перед забором жидкостей на ПЦР-исследование запрещено принимать некоторые препараты (например, прием некоторых антибиотиков нужно прекратить за две недели до забора материала).
Требования к лаборатории, в которой проводится забор анализов на ПЦР очень строгие. Лаборатория должна быть стерильна, чтобы не произошло перекрестное загрязнение материала. В этом случае результаты могут быть ложноположительными.

ПЦР-тест на туберкулез — высокоточный информативный анализ. И требования к его проведению крайне строгие. Чтобы анализ получился, нужно соблюдать регламент.

Для работы в ПЦР-лаборатории приглашаются специально обученные врачи: бактериологи, вирусологи, микробиологи. Все они прошли дополнительное обучение для работы на сложном оборудовании.

Лаборатория должна иметь лицензию на выполнение работ связанных с бактериологически-опасными вирусами и бактериями.

В самой лаборатории должны быть выделены такие рабочие зоны:

Зона приемки и сортировки проб.
Зона подготовки проб. В этом помещении выделяются нуклеиновые кислоты из образцов материала.
Зона проведения реакционных проб.
Зона для учета результатов и расшифровки анализов.

Все помещения располагают последовательно. Допуск в эти зоны разрешен только работающим там сотрудникам, которые при входе соблюдают правила личной защиты от бактерий и вирусов.

Лучше, если есть возможность расположить лабораторию в отдельно стоящем здании с собственной системой вентиляции.

В лаборатории соблюдаются стерильные условия работы, чтобы избежать перекрестного загрязнения проб. Даже если один фрагмент чужеродной ДНК попадет в исследуемый материал, ПЦР его размножит, и анализ получится ложноположительным.

В каждой зоне лаборатории имеется свой набор оборудования и посуды для проведения исследований. Также имеются свои холодильники, которые не могут быть использованы в других целях, кроме хранения материала конкретной зоны исследований.

Использованные расходные материалы и остатки биологического материала уничтожаются специальными способами, в соответствии с инструкциями.

ПЦР-тест на туберкулез имеет множество плюсов, которые делают этот метод диагностики все более востребованным:

Срок проведения. Несмотря на сложность проведения анализа, он готовится намного быстрее других лабораторных методов диагностики туберкулеза (около пяти часов). Это свойство анализа ПЦР становится особенно важным, когда анализ необходимо провести экстренно.
Анализ ПЦР абсолютно безопасен и может проводиться беременным женщинам и детям.
ПЦР-исследование можно сделать, когда по каким-то причинам нельзя выполнить другие методы диагностики.
С помощью ПЦР-диагностики можно провести исследование любой биологической жидкости на выбор. В некоторых случаях это имеет большое значение.
Позволяет обнаружить возбудителя на любой фазе заболевания. Даже после проведенного лечения, сохранившиеся остатки ДНК мертвых микобактерий будут обнаружены.
Высочайшая чувствительность этого метода позволяет обнаруживать в биологическом материале даже единичные фрагменты ДНК микроорганизмов.
Метод ПЦР позволяет не только обнаружить присутствие заболевания, но и может определить генотип возбудителя, отличив его от похожих микроорганизмов.
ПЦР-исследование очень эффективно при рецидивирующем течении заболевания.
Благодаря высочайшей чувствительности, анализ ПЦР может распознать микобактерии в организме человека, когда он только недавно инфицировался туберкулезом, задолго до появления клинических симптомов.

Казалось бы, метод ПЦР-диагностики содержит в себе только плюсы, но это не так.

Минусы этого метода исследования тоже существенны. При выборе метода исследования туберкулеза это также стоит учитывать:

Это дорогостоящий метод исследования. Для проведения ПЦР-диагностики нужна специально-оборудованная лаборатория. Оборудование для таких исследований стоит очень дорого, и не во всякой лаборатории оно имеется. В крайнем случае, можно обратиться в платную лабораторию.
Сразу же после проведенного лечения метод ПЦР применять не рекомендуется. В крови пациента некоторое время сохраняется небольшое количество живых и мертвых микобактерий. Если провести анализ в этот период, он покажет ложноположительный результат.
При мутациях микобактерий, анализ будет недостоверным, так как нормальная ДНК не сможет синтезироваться.
Для ПЦР-исследования имеет значение правильный выбор биологической жидкости на анализ.
Сверхчувствительность. Это тот случай, когда достоинство метода становится его недостатком. Если при проведении анализа в биологический материал каким-то образом попадет даже единичный фрагмент чужеродного ДНК, то ПЦР его размножит, и будет получен ложный результат.

ПЦР-лаборатория имеется только в крупных противотуберкулезных диспансерах и диагностических центрах.

Объясняется это высокой стоимостью оборудования и высокими требованиями к содержанию лаборатории (реактивы, обработка).

Медицинские чиновники не сильно переживают из-за отсутствия ПЦР-лаборатории в каком-то конкретном населенном пункте, поскольку анализы на туберкулёз можно провести другими методами (культивирование микобактерий, микроскопическое исследование).

Если в населённом пункте нет бесплатной ПЦР-лаборатории, пациент по желанию может обратиться в платное учреждение.

В последнее время ПЦР-диагностика занимает все более прочные позиции в диагностике туберкулеза и других заболеваний, отодвигая на задний план другие методы диагностики.

источник

Возбудителем туберкулеза является микобактерия под названием туберкулезная палочка или палочка Коха. Попадая в организм человека, она может длительное время себя никак не проявлять. Но со временем, как только возникнут благоприятные условия, бактерия может вызвать туберкулез легких или других органов.

Для успешной борьбы с этим заболеванием очень важно диагностировать его на ранних стадиях. Анализ крови на туберкулез методом ПЦР является самым эффективным и быстрым способом диагностики туберкулеза. На его проведение достаточно четыре часа. Он более удобен, чем другие методы, у него меньше противопоказаний и почти стопроцентная достоверность.

На сегодняшний день анализ ПЦР является одним из новейших методов диагностики различных заболеваний организма. Для выявления туберкулеза этот способ самый эффективный, по сравнению с другими способами, применяемыми до сих пор. Метод был открыт в 1983 году известным химиком К.Мюллисом, через десять лет получившим за него Нобелевскую премию.

В основе этого способа применяется полимеразная цепная реакция, позволяющая определить не только наличие возбудителя в крови, но и его вид. С этой целью при помощи ПЦР метода, выявляется часть ДНК возбудителя и проводится его идентификация. Даже если в крови находится несколько разных возбудителей, эта методика позволяет обнаружить их всех.

Анализ крови ПЦР на туберкулез назначают пациенту, когда есть подозрение на наличие туберкулезной палочки, но другими методами она не обнаруживается.

При желании каждый может сдать этот анализ самостоятельно, обратившись в клинику, где его проводят, например в ИНВИТРО. Это одна из крупнейших частных компаний, содержащих медицинские лаборатории во многих странах.

В настоящее время нет более точного анализа для выявления палочки Коха в организме пациента. Общий анализ крови эффективен, но позволяет получить положительный или отрицательный результат только спустя достаточно длительное время. Для этого делается посев исследуемого материала на питательную среду и лишь через несколько недель становится видно, идет ли размножение бактерии.

Метод ПЦР позволяет выявить ДНК бактерии за считанные часы, что является большим плюсом для диагностики. Кроме того, анализ позволяет точно идентифицировать бактерию, даже если ее в крови очень мало.

Данный метод исследования почти не имеет противопоказаний. Ввиду того, что используется кровь, состояние пациента не имеет значения. Наличие простудных заболеваний не влияет на результат анализа.

Не рекомендуется его проводить после прививки, а также после недавно проведенного лечения. Это объясняется тем, что организм еще не очистился, и остатки бактерий могут повлиять на результат.

Анализ крови ПЦР на туберкулез имеет ряд преимуществ перед другими методами исследования, такими как реакция Манту или рентген. Среди них можно выделить следующие качества:

Быстрота выполнения. По сравнению с другими анализами ПЦР делается в течение нескольких часов.
Для проведения процедуры можно использовать не только кровь, но и другие биологические выделения организма.
Процедура не имеет противопоказаний, ее можно проводить не только взрослым, но и детям. Также подходит беременным женщинам без вреда для их здоровья.
Метод позволяет выявить заражение крови бактериями на самых первых стадиях, когда еще нет внешних признаков заболевания.
Методика позволяет выявить возбудителя при самых малых количествах бактерий в материале.
Дает хороший эффект при исследовании больного, заразившегося повторно.
Анализ можно брать независимо от того, как себя чувствует пациент. Например, реакция Манту делается, если у больного нет простудных заболеваний и повышения температуры. В данном случае таких ограничений нет.

Как видно из предоставленного списка, этот метод диагностики гораздо предпочтительнее, чем другие. Он абсолютно безвреден для пациентов, страдающих аллергическими реакциями. Его можно успешно использовать взрослым и детям. Методика позволяет сэкономить время на диагностику и быстрее начать лечение.

Метод также удобен для людей из провинции, где нет соответствующих лабораторий. Им не приходится приезжать несколько раз в клинику, достаточно одного дня, чтобы получить результат анализов и назначение лечения от врача.

Кроме преимуществ у этого метода есть ряд недостатков, которые могут быть препятствием для проведения анализа ПЦР:

Относительная дороговизна процедуры. Для проведения такого анализа необходимо дорогостоящее оборудование и не каждая клиника может себе это позволить. Оно есть в крупных лабораториях частных компаний. Цены там, как правило, всегда высокие.
Анализ дает правильный результат лишь в том случае, если материал для исследования правильно подобран. К примеру, при туберкулезе мочеполовой системы, исследование крови наличие заболевания не покажет. В этом случае нужно собрать мочу или выделения из мочеполовых органов.
Метод не всегда дает точного результата у детей. Это объясняется влиянием прививок. Например, после прививки БЦЖ делать этот анализ не рекомендуется.
Есть вероятность получения ложноположительного или ложноотрицательного результата. Что это такое? Способ обладает очень высокой чувствительностью. При сборе материала должна соблюдаться повышенная стерильность. В случае если в материал попадет самое малое количество посторонних бактерий, анализ будет испорчен, результат исказится.

Несмотря на недостатки, метод достаточно широко используется. Например, в тех случаях, когда необходимо срочно определить заболевание у пациента. Его могут назначить беременным при подозрении на инфекцию, способную угрожать ребенку или матери. Иногда назначают детям перед принятием в детский сад. Но это по желанию родителей.

Перед взятием анализа пациенту необходимо провести подготовительные мероприятия. Они зависят от того, какой материал будет сдаваться:

Если необходимо сдать кровь, должна быть подготовлена стерильная пробирка. В нее добавляется антикоагулянт – специальный раствор, препятствующий свертыванию крови. В него помещается собранный материал и осторожно смешивается. Кровь собирают одноразовым шприцем из вены.
Процедура проводится утром натощак. Хранится кровь в холодильнике не более пяти часов. Если пренебречь этим правилом, результаты анализа могут быть неточными.
За неделю до сдачи биоматериала следует прекратить прием любых лекарств.
Нельзя сдавать кровь после приема алкогольных напитков.
При наличии хронических инфекционных или воспалительных заболеваний процедура переносится до тех пор, пока человек полностью не выздоровеет.

Обязательно во время процедуры необходимо соблюдать по возможности максимальную стерильность. Поэтому важно сдавать анализы только в проверенных клиниках под руководством опытного специалиста. Следует помнить, что минимальное попадание посторонних микроорганизмов может дать неправильный результат. Во избежание этого, доктор может назначить повторное исследование.

Чтобы сдать кровь на анализ, больной должен не принимать пищу более шести часов. Лучше всего проходить процедуру утром натощак. Кровь забирается из локтевой вены через одноразовую иглу сразу в стерильную пробирку. Туда же вводится антикоагулянт, чтобы кровь не свернулась. Смешивать содержимое пробирки следует осторожно, не допуская резких движений.

Если кровь была взята вне лаборатории, ее надо немедленно доставить лаборанту. Для проведения анализа на туберкулез она должна храниться не более пяти часов. По истечении этого времени результат может быть неточным. Взятие материала вне лаборатории допускается только в том случае, если пациент не может приехать в больницу по состоянию здоровья. Например, он лежачий, и нет возможности нанять соответствующий транспорт.

Результат ПЦР может быть либо положительным, либо отрицательным. Положительный означает присутствие бактерии в организме. Отрицательный свидетельствует о том, что она отсутствует. Хотя не всегда положительный результат говорит о туберкулезе. Он может быть ошибочным, поэтому для подтверждения диагноза требуется пройти дополнительные диагностические тесты.

Вся остальная информация сложна для восприятия больного, и ею занимается специалист. При положительном результате врач назначает необходимое лечение.

Цена процедуры может отличаться в зависимости от медицинского центра, где она проводится. Подробнее в нижерасположенной таблице.

Название клиники	Стоимость
Клиника современной медицины	от 750 рублей
Инвитро	от 765 рублей
Лаборатория Пастер	от 900 рублей

Метод ПЦР для анализа на туберкулез сравнительно новый, и многие пациенты с ним еще не знакомы. В большинстве случаев больные предпочитают Манту и флюорографию. Но, как показывает практика, этот способ диагностики более эффективный и в конечном итоге полностью себя окупает.

Отсутствие противопоказаний и быстрота выполнения делает его привлекательным по сравнению с другими анализами. Медицина не стоит на месте и этот метод с каждым разом усовершенствуется и становится все более надежным.

источник

На данный момент существует достаточное количество лабораторных способов определения бактерий Коха. У каждого имеются определенные преимущества и недочеты, например, требуется наличие определенной концентрации клеток в пробе или достаточное время для культивирования.

На данный момент более приемлемым анализом считается ПЦР на туберкулез, который характеризуется высокой результативностью (100%) даже при наличии небольшого количества фрагментов генетического аппарата микобактерий Mycobacterium tuberculosis. Полимеразная цепная реакция дает возможность выявлять ограниченные и диссеминированные формы патогенеза, что важно при обследовании детей, когда микробиологическая диагностика не дала результата.

Туберкулез – инфекционное заболевание, вызываемое микобактерией – палочка Коха. Чаще поражаются легкие, но очаги могут быть и в других тканях. Передается респираторно, а также со слюной, кровью, при совместном использовании бытовых приборов и тесном контакте в быту.

Заболевание протекает в двух формах:

Закрытая стадия. Больной при контакте не опасен для окружающих. В мокроте анализы не выявляются признаки возбудителей, ложной будет и ПЦР диагностика на туберкулез. При отсутствии лечения патогенез усугубляется.
Открытая стадия. Палочка Коха присутствует в биологических жидкостях человека, легко диагностируется лабораторными методиками. В таком состоянии человек является опасным для окружающих.

Обратите внимание. Поскольку начало туберкулеза легких протекает латентно, то проводится скрининг. Взрослые люди должны раз в год или два (зависит от региона проживания) проходить флюорографию, которая показывает наличие инфильтрата в тканях. Это дешёвый и быстрый способ диагностики.

На данный момент для выявления опасных микобактерий проводят ряд анализов:

методы рентгенографии;
КТ или МРТ;
туберкулиновые пробы (реакция Манту).

Однако именно анализ крови на ПЦР на туберкулез дает наиболее достоверный результат, причем определяет наличие инфекции вне зависимости от локации очага.

Врач фтизиатр, пульмонолог или терапевт может направить больного на прохождение диагностики при наличии подозрений.

Кроме этого, тест ПЦР на туберкулез требуется, если:

возможны внелегочные очаги;
наличие признаков бактериемии на фоне туберкулезной инфекции (субфебрилитет, потливость и прочие);
при регулярном контакте с инфицированным человеком;
при ВИЧ-инфекции;
ПЦР диагностика туберкулеза у детей показана при ненормальной реакции на пробу Манту;
сильные увеличения лимфоузлов при заболевании нижних дыхательных путей (прикорневые воспаления легких, бронхиты);
кровохарканье при этом человек слаб и быстро утомляется;
длительный кашель после острых бронхитов и пневмоний.

Полимеразная цепная реакция основана на узнавании целых цепочек бактериальной ДНК и РНК или их фрагментов, находящихся в крови пациента или других биологических жидкостях:

мокрота;
легочные и бронхиальные смывы;
моча.

Обратите внимание. Высокая результативность данной методики основана на принципе работы фермента полимеразы (основная функция сборка нуклеиновых молекул). Она может узнавать даже самые мелкие фрагменты генного материала возбудителя. Поэтому результат будет положительный или отрицательный.

Преимущества анализа ПЦР на микобактерии туберкулеза:

выявление специфических последовательностей ДНК микобактерий;
точность – 98%;
чувствительность анализа не менее 100 ДНК-копий в 5 мкл пробе, прошедшей особую обработку;
срочный анализ дает возможность получить результат в течение 4 ч., после забора крови.

Использование полимеразной цепной реакции существенно облегчило определение многих заболеваний (не только туберкулеза). Причем метод позволяет регистрировать наличие патогена на самых начальных стадиях патогенеза, когда нет еще никаких признаков. Гарантированность результата обеспечивается благодаря тому, что полимераза среди тысяч клеток может находить по определенному маркеру комплементарные (подходящие) только ей последовательности бактериальных генов или даже их фрагменты.

Помимо этого, ПЦР при туберкулезе помогает выяснить уровень резистентности к назначенной терапии и скорректировать лечение, что в разы повышает его эффективность. Длительность такого анализа три, максимум четыре дня, но при этом врач получает данные, существенно меняющие качество противотуберкулезной терапии. Более подробно обо всех нюансах полимеразной цепной реакции изложено на видео в этой статье.

Инструкция проведения анализа на данный момент не представляет особой сложности: сначала проводится отбор исследуемого материала, после чего выделяется ДНК и проводится его классификация по типу патогенной бактерии. Основные моменты указаны в таблице.

Таблица. Как проводится анализ ПЦР на туберкулез:

Полученный материал должен быть на несколько минут нагрет до высоких температур (97º С). Такая мера нужна для расщепления парных молекул нуклеиновых кислот на отдельные цепи (разрыв спирали). Это нужно для того, чтобы полимераза начала работу. При понижении температуры особая молекулярная структура праймер, ассоциируется с одной из свободных цепей ДНК, что позволит в дальнейшем инициировать сборку новой спирали. Если полимераза нашла нужные бактериальные последовательности и начала сборку, то результат положительный, в противном случае отрицательный.

Для получения достоверного результата, дающего максимальную точность, понадобится проведение около 25–30 циклов, что даст возможность получить необходимое количество копий бактериальных ДНК. При этом они подлежат классификации. Это требует наличия специально оборудованной лаборатории, поэтому не во всех регионах есть возможность проведения ПЦР. Соответственно и цена исследования не является низкой.

В особых случаях данный метод является единственно возможным или крайне необходимым, например:

при наличии противопоказаний к другим диагностикам;
в спорных ситуациях;
при рецидиве туберкулеза;
определение стадийности патогенеза.

Заметка. Если анализ ПЦР проводится для человека после противотуберкулезной терапии, то результат может быть ложноположительным. Это связано с наличием в крови очень малого количества мертвых бактерий или они еще находятся на стадии лизиса (клеточной смерти).

Суть метода та же, что и при исследовании крови. Однако в данном случае требуется определенный алгоритм сдачи и подготовки. ПЦР мочи поможет выявить микобактерии при наличии очагов в органах выделительной системы и подобрать соответствующую терапию.

Перед забором урины важно хорошо вымыть гениталии. Утреннюю мочу (среднюю порцию) собирают в контейнер и отправляют в лабораторию. Других подготовительных мер не требуется, питание накануне анализа остается без изменений.

источник

Инновационный метод выявления микроорганизмов, в конце прошлого столетия изобретенный ученым Кэри Муллисом – анализ ПЦР. Он получил за свои труды Нобелевскую премию. Полностью этот процесс имеет название полимеразой цепной реакции. Он заключается в восстановлении типа микроорганизма в предоставленном биоматериале по коротким фрагментам ДНК. Это позволяет выявить инфицирование на ранней стадии и сразу начать лечение, не доводя до появления серьезных симптомов и осложнений.

Диагностика методом ПЦР заключается в получении сегментов патогенной ДНК из биологического материала и выстраивание их в правильную цепочку. Это позволяет идентифицировать микроорганизм, которому принадлежат клетки.

Процедура проводится в три этапа:

Сбор биологического материала.
Выявление и выстраивание ДНК.
Распознавание инфекции.

Для этого исследования требуется специальное медицинское оборудование – амплификатор. Он оснащен камерой, где исследуемый материал взаимодействует с высокой температурой и химическими ферментами. На выходе лаборант имеет длинную цепочку ДНК возбудителя болезни, если таковой имеется в организме человека.

Анализ ПЦР – это сложный генно-инженерный процесс, требующий аккуратности и серьезного отношения, как от лаборантов, так и от пациентов. Большую роль в корректности результатов анализа играет подготовка к процедуре, то есть правильный сбор материала.

Основными источниками для получения информации о болезни являются:

Могут использоваться и другие варианты, жидкости при необходимости берутся на анализ из разных органов.

Для пациента предусмотрены определенные правила, которые нужно выполнять перед процедурой. Если предстоит анализ крови, то запрещается за 8 часов до сбора:

употреблять пищу;
курить;
пить алкогольные напитки;
принимать внутрь лекарственные средства.

Вечером перед сбором мокроты выпивается препарат для ее разжижения и облегчения отхаркивания. Утром собрать материал после тщательных гигиенических процедур полости рта.

Моча собирается в стерильную баночку утром натощак, после подмывания, до приема каких-либо медикаментов.

Если человек принимает антибиотики, то проведение анализа полимеразной цепной реакции следует отложить, иначе результат ПЦР не является достоверным. Сдавать мокроту или кровь следует спустя две недели после окончания курса лечения.

Если описать кратко, то процесс заключается в выделении части ДНК. Применение современных методов генной инженерии позволяет определить вид микроорганизма. Причем материала для анализа нужно небольшое количество.

Технически это очень сложная процедура, но она занимает меньше времени, чем классические бактериологические исследования. Возбудителей не нужно выделять из биоматериала, нет нужды растить их в течение нескольких недель. В день сдачи пациент уже может узнать результат своего анализа.

Весь процесс ПЦР протекает поэтапно:

Ведется работа с первичной формой ДНК, которая при высокой температуре, близкой к 100 градусам, делится на две цепочки.
Температура понижается, нити соединяются с фрагментами нуклеиновой кислоты – праймером.
Происходит элонгация – синтез молекулярной структуры.

Весь сеанс состоит примерно из тридцати таких процедур, повторяющихся циклом как цепная реакция. Это необходимо для создания того количества клеток, при котором полученные бактерии станут распознаваемы.

Описание результата ПЦР (полимеразной цепной реакции) дает фтизиатр, она бывает простой или развернутой. В первом случае описание будет содержать только информацию о наличии или отсутствии палочки Коха. Если расшифровка подробная, из нее можно узнать степень распространения болезни, ее очаг. По этим критериям можно определить наиболее подходящее лечение туберкулеза в каждом случае.

Анализ полимеразой цепной реакции не различает живых и мертвых возбудителей, а говорит только об их наличии. Поэтому имеет смысл сдавать повторный тест на туберкулез только через 3-4 недели после прохождения назначенной врачом терапии.

Если результат положительный, на заключении ставится надпись «Mycobacterium tuberculosis». При отрицательном результате, рядом с биологическим названием бактерии есть пометка «не обнаружены». Анализы могут оказаться ложноположительными. Такое происходит редко – при нарушении техники выполнения исследований ПЦР или при наличии нежизнеспособных микроорганизмов. Окончательный вывод о заболевании может сделать только врач-фтизиатр.

ПЦР-диагностика туберкулеза завоевала популярность по многим причинам. Она имеет массу достоинств, среди которых:

Точность исследования. При проведении анализа с соблюдением технологии удается выявить бактерии, даже если они присутствуют в малом количестве.
Быстрый результат. Весь процесс от сбора материала до готового заключения занимает около 5 часов. Если сравнить с посевом, его приходится ждать до нескольких недель.
Полная безопасность для человека, в отличие от флюорографии с ее облучением.
Используется любой жидкий биоматериал. Для осуществления ПЦР при туберкулезе легких наиболее точную информацию дает мокрота, при туберкулезном менингите берется образец из спинного мозга. Анализ крови помогает выявить местные очаги инфекции.
Проверяется чувствительность бактерий к антибиотикам. Это позволяет назначить правильное лечение.
Ранняя диагностика. Узнать о наличии заболевания можно до появления ее симптомов.

Кроме положительных моментов есть и недостатки. Главный из них – это цена. Анализ ПЦР не из дешевых, что связано с использованием дорогого оборудования. Еще один минус – необходимость выжидать время для проведения повторного теста после курса лечения от туберкулеза. Иногда результат проверки получается ложноположительным. Такое бывает из-за мутации бактерий.

ПЦР на туберкулез легких не имеет противопоказаний и абсолютно безопасен. Поэтому есть определенные ситуации и заболевания, когда это единственная возможность исследования.

беременность;
контакт с туберкулезным больным;
трудности в определении диагноза при заболевании легких;
обследование перед операцией;
аллергическая реакция;
ВИЧ-инфекция;
малолетний возраст.

Воспользоваться методом ПЦР можно по направлению, которое выдается в фтизиатрии, а также педиатром, терапевтом или пульмонологом.

Другие виды обследования не изжили себя, а продолжают использоваться. Их применяют в тех случаях, когда нет возможности выполнить ПЦР на туберкулез. К тому же современный метод неидеален, иногда его показатели подвергаются сомнению и требуют перепроверки.

Определить наличие туберкулеза у человека помогают следующие способы:

туберкулинодиагностика (Манту);
флюорография;
тестирование биологического материала на флору;
рентген легких.

Эти исследования являются бесплатными и доступными для каждого. Но у них есть свои недостатки:

Тест на туберкулез вызывает аллергию. Противопоказан при заболеваниях кожи.
Рентгенологические исследования сопровождаются облучением, что неприменимо к детям, людям с иммунодефицитом и беременным женщинам.
Бактериологические анализы занимают гораздо большее количество времени, результата можно ждать до месяца.

Альтернативные варианты не являются гарантией стопроцентно правильного заключения. Они чаще всего используются в профилактических целях. Диагностирование туберкулеза методом ПЦР дает наиболее достоверную информацию. Если есть возможность, то лучше воспользоваться именно им.

Ребенка следует особенно оберегать от заболевания – туберкулезная инфекция может нанести серьезный вред организму с еще не совсем сформировавшимся иммунитетом.

После попадания палочки Коха в детский организм развитие заболевания проходит такие стадии:

Латентная. Продолжается до года, не выдавая себя никакими симптомами.
Интоксикация. Сказывается на общем состоянии здоровья. Появляется слабость, апатия, отсутствие аппетита, сонливость и снижение работоспособности. Постоянно немного повышена температура.
Первичная форма заболевания. Туберкулез локализуется, образуя очаг заболевания. У ребенка возникает кашель, одышка, головная боль, увеличение лимфоузлов.
Туберкулезный бронхоаденит. Симптомами являются боль в лопатках, кашель с разной тональностью звука, хрипы.

Обычно для выявления инфекции под кожу ребенка вводится туберкулин. Если к этому виду обследования имеются противопоказания, то ПЦР на туберкулез – незаменимый вариант для диагностики. Дети обычно сдают анализ крови, но при необходимости собирается и мокрота. При малейшем подозрении на наличие туберкулез проводятся дополнительные исследования, чтобы убедиться в положительном результате и сразу начать лечение на ранней стадии, не допуская развития болезни.

Современные методы исследования всегда быстрее и надежнее. Жаль, что из-за дорого оборудования сделать такие анализы есть возможность не во всех медицинских учреждениях и населенных пунктах. Каким способом провести обследование обычно выбирает врач, но и у пациента есть право выбора. Если вам приходилось сдавать анализ ПЦР, расскажите об этом в комментариях. Если статья оказалась для вас полезной, поделитесь ей в соцсетях – возможно, она поможет вашим друзьям.

источник

Что такое ПЦР диагностика
Ответственность перед сдачей анализов
Процесс сбора анализов
Как расшифровываются результаты

В последнее время ПЦР на туберкулез считается наиболее точным анализом, хотя и существуют другие методы. Данное заболевание набирает обороты, поэтому специалисты стараются изобрести новые технологии по выявлению палочки Коха в организме. Всем известно, что туберкулез является инфекционной болезнью, которая может передаваться как воздушно-капельным путем, так и через насекомых и т.д. поэтому крайне важно проводить периодические обследования.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет всего в течение нескольких часов обнаружить возбудителя инфекции, причем выявить можно даже 1-2 молекулы среди огромного количества. Данный тест имеет массу достоинств, которые проявляются в следующем:

100%-ное выявление, так как в биологической пробе определяется от 10 до 100 клеток;
специфичность ДНК МБТ является очень высокой;
скорость анализ имеет от 4 до 4,5 часа;
диагностика туберкулеза легких, что практически нереально для других методов;
выявляется особенный фрагмент, который имеется только в конкретном возбудителе.

С помощью этой диагностики можно своевременно не только обнаружить инфекцию, но и изолировать человека и назначить ему соответствующее лечение. Особенно это касается туберкулеза, потому что точное расположение палочки Коха выявить проблематично. Кроме того, данный анализ способен исследовать устойчивость микобактерий к определенному медицинскому препарату, тем самым определяется метод лечения. Чтобы провести полимеразную цепную реакцию на устойчивость, используют гены, запоминающие невосприимчивость к некоторым лекарствам, после чего через двое суток можно получить результат. Это благотворно сказывается на профилактике заболевания.

Следует отметить, что ПЦР выявляет возбудителей не только туберкулезной палочки, но и многих других заболеваний и даже ВИЧ. Анализ проводится с любой биологической жидкостью. Это могут быть:

кровь;
моча;
кал;
выделения половых органов;
мокрота;
жидкость спинномозговая;
соскоб со всех органов.

Собранный материал помещается в специальный амплификатор, то есть реактор, где находятся некоторые ферменты, благодаря которым идет цепная реакция по удвоению ДНК инфекции. После этого производится расшифровка. Результат, как правило, бывает либо положительный, либо отрицательный.

Назначается диагностика туберкулеза в тех случаях, когда, во-первых, существуют основные симптомы болезни, во-вторых, человек очень длительное время болеет острыми заболеваниями дыхательных путей и, в-третьих, люди контактируют с больными туберкулезом. Но врач может провести данный анализ и при наличии сомнительных снимков после рентгенологического обследования.

На полимеразную цепную реакцию могут направить такие специалисты, как пульмонолог, фтизиатр, терапевт, а детей — педиатр. Конечно, есть правила, которые необходимо соблюдать пациенту перед сдачей, например, крови на туберкулез. Прежде всего, нельзя употреблять пищу за 4-5 часов до сдачи, а за сутки до этого нужно исключить из своего рациона жирные и аллергенные продукты. Также желательно не использовать антибиотики и личные средства гигиены в виде гелей.

Но не только больной обязан соблюдать необходимые условия. То же относится и к врачам. Чтобы забор анализов на туберкулез был проведен правильно, нужно делать это только в стерильных условиях, иначе в жидкую среду могут попасть другие микроорганизмы, следовательно, интерпретация будет неверной. Все инструменты, приборы и контейнеры тоже должны быть в стерильном виде.

Итак, материал собирается в специальные контейнеры, которые при необходимости специалист дает пациенту. Например, моча собирается только первая после пробуждения человека утром. Но при этом необходимо провести утренние водные процедуры в соответствующих местах. Мочи для сбора достаточно от 20 до 30 мл. А вот синовиальную жидкость из спинного мозга и прочие сложные анализы берет только высококвалифицированный специалист, находящийся в стационарных условиях.

У женской половины человечества мазок берет только гинеколог на специализированном кресле, а у мужчин соскоб или мазок забирается из мочеиспускательного канала (из наружной части). Из зева мазок берет врач специальной лопаткой или другими инструментами. Кровь берется непосредственно из вены стерильными шприцами.

На последнем этапе сбора доктор с учетом всех требований транспортировки и хранения направляет образец в специальную лабораторию для дальнейшего исследования. Для этого персонал лаборатории помещает кровь или прочие мазки в пробирку, в которую заблаговременно добавлено вещество, препятствующее преждевременному старению образца.

В случае с кровью, что особенно важно, данное вещество не позволяет ей свернуться, следовательно, наличие сгустков исключено. Пробирки при этом не встряхиваются, так как можно повредить состояние эритроцитов. Это все нужно для того, чтобы легче и быстрее было определить все компоненты крови.

Потом кровь на туберкулез центрифугируют, чем отделяют от плазмы клеточный осадок, который и изучается под микроскопом. Изучив первоначальные данные, добавляют фермент (транскриптазу) и при определенном температурном режиме проводят следующую цепную реакцию. Благодаря этому образуются фрагменты генетического материала, которые и подвергаются расшифровке.

Не всегда анализ бывает правдивым. Ложноположительный результат бывает только в том случае, если не соблюдены все требования по подготовке и сдаче мазков и т.д. Именно поэтому следует как пациенту, так и врачам строго придерживаться всех правил, о которых говорилось выше.

Расшифровка может быть как простой, так и сложной. К первой относится определение «отрицательно» или «положительно», что свидетельствует о том, что при отрицательной расшифровке пациенту не о чем беспокоиться, т.к. инфекций не обнаружено.

При положительных результатах простой формы количество содержащихся возбудителей является ничтожно малым. Дело в том, что в медицине существуют определенные нормы, благодаря которым можно определить степень устойчивости к заболеваниям.

Но в сложной расшифровке теста определяется конкретное содержание тех или иных микроорганизмов, что позволяет сделать самые точные выводы. Естественно, ни один пациент не сможет самостоятельно расшифровать все эти цифры, а врач способен подробно объяснить больному.

Именно эти цифры показывают, где расположены очаги, на какой стадии находятся и что является причиной возникновения заболевания туберкулезом.

На основании расшифровки специалисты назначают метод лечения и пр. Никогда не стоит забывать о том, что малейшее наличие возбудителей свидетельствует об их присутствии в организме. Поэтому рано или поздно инфекция может распространиться дальше и стадия туберкулеза увеличится. Не следует безответственно относиться к собственному здоровью, всегда следуйте рекомендациям специалистов.

источник

Туберкулёз — специфическая инфекция, его очаг может находиться в тканях человека годами, а после чего распространиться в течение нескольких месяцев. Это хроническое заболевание, оптимальные схемы лечения которого сложно подобрать. Одна из причин этого — запоздавшая диагностика, когда микобактерии, находясь в организме человека, уже адаптировались ко многим препаратам.

Какие современные методы постановки диагноза существуют? ПЦР диагностика — что это такое? Как проводится это исследование? В каких случаях туберкулёз диагностируется этим методом и в чём его суть?

Это один из самых современных методов диагностики не только заболеваний, но и обнаружения биологического материала. ПЦР диагностика была изобретена относительно недавно. Около 30 лет назад в 1983 году американский биохимик Кэри Бэнкс Муллис предложил сложную схему восстановления биологического материала микроорганизмов по одному краткому сегменту. Благодаря своему открытию учёный был удостоен наивысшей награды — Нобелевской премии.

Что это такое — ПЦР диагностика инфекций? Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — это диагностика выявления вирусных заболеваний, основанная на методах генной инженерии. Она широко применяется в медицинской микробиологии, иммунологии и вирусологии. Метод универсальный и помогает поставить диагноз при малом количестве материала. Выявить инфекцию можно буквально в первые часы заражения ею, задолго до того, как проявятся первые симптомы заболевания.

Суть метода заключается в получении из материала от больного человека не самого возбудителя, а фрагментов генома (частиц ДНК), его биосинтезе с последующим определением к какому классу микроорганизмов принадлежит полученный генетический материал с помощью молекулярно-генетических методов.

Несмотря на то что это сложный процесс, он занимает намного меньше времени, чем многие биологические способы обнаружения возбудителей инфекций. В течение всего нескольких часов с помощью ПЦР удаётся обнаружить микроорганизм. Для этого нет необходимости выделять его из среды (крови, спинномозговой жидкости, мокроты) и долго выращивать на искусственных питательных средах. Достаточно чтобы в исследуемом материале присутствовал небольшой фрагмент нити ДНК возбудителя инфекции.

В основе реакции лежит возможность в искусственных условиях (в пробирке) создать синтез молекул нуклеиновых кислот возбудителя инфекции.

Что необходимо для проведения ПЦР?

Праймеры — участки ДНК, с которых и начинается биосинтез или создание.
Нуклеотиды или сложные соединения, которые являются основой молекулы ДНК либо РНК.
Полимеразная цепная реакция невозможна без присутствия полимеразы, которая представляет собой фермент ускоряющий ход ПЦР.

Как проводится молекулярная диагностика методом ПЦР? Процедура несложная и занимает короткий промежуток времени с учётом сбора материала.

Перед началом исследования берут необходимый биологический материал — это промывные воды бронхов, кровь, желудочное содержимое, мокрота. Тип биологического материала зависит от предполагаемого возбудителя.
Денатурация или разрушение первичной структуры ДНК, которая состоит из двух цепочек. Суть этого этапа — разъединить две цепи под воздействием высокой температуры (максимальная — 98 ºC, которая действует не более двух минут).
На следующей стадии ПЦР, под названием — отжиг, температуру снижают на несколько градусов, чтобы праймер связался с нитью ДНК.
Элонгация, в процессе которой происходит непосредственно синтез нужных молекул.

В результате всего 25–30 таких циклов получают нужное количество копий ДНК микроорганизмов, которые легко распознать.

Нет возможности абсолютно всем людям с подозрением на туберкулёз проводить ПЦР, так как метод требует наличия дорогостоящего оборудования. Не все государственные поликлиники могут себе позволить купить его. Кроме этого, так сложилось, что привычные методы диагностики инфекции в большинстве случаев тоже себя оправдывают.

опрос пациента, сбор анамнеза;
полноценный осмотр человека;
исследование с помощью туберкулиновой пробы Манту;
рентгенография или флюорография;
компьютерная диагностика при необходимости;
микробиологические методы исследования: микроскопия мазка и бактериологическое исследование мокроты.

ПЦР на туберкулёз проводится в особых случаях, когда сложно поставить диагноз или нет возможности провести другие инструментальные методы.

Несмотря на изобилие способов диагностики заболеваемость туберкулёзом продолжает расти. В настоящее время отмечается не только её рост, но и другие особенности:

болезнь часто протекает в тяжёлой форме;
повышается количество летальных случаев;
всё чаще диагностируются устойчивые к современным химиопрепаратам формы заболевания.

Нежелание самих людей ежегодно проходить обычные профосмотры, отказ от вакцинации приводит к распространению туберкулёза. В таких условиях нужны быстрые, информативные и эффективные методы исследования, которые должны быть доступны для детей и взрослых. Все вышеперечисленные методы диагностики во многом уступают ПЦР.

Это исследование хоть и новое, но хорошо себя зарекомендовало, особенно в спорных случаях, когда диагноз поставить невозможно по ряду причин.

Благодаря ПЦР намного легче обнаружить в исследуемом материале ДНК возбудителя туберкулёза.

Преимущества ПЦР диагностики в следующем.

Это быстрый анализ. По небольшому фрагменту молекулы ДНК можно установить диагноз всего за несколько часов (около пяти), что успешно используется в экстренных ситуациях, когда, например, перед операцией нужно установить не болен ли человек туберкулёзом.
Анализ ПЦР допускается в случае, когда другие методы недоступны или запрещены (для обнаружения туберкулёза лёгких иногда приходится сделать несколько рентгенографических снимков, что составит большую дозу облучения).
С помощью ПЦР проводится исследование любой биологической среды на присутствие в ней возбудителя. К примеру, можно провести исследование спинномозговой жидкости, если есть подозрение на туберкулёзный менингит.
Разрешена ПЦР диагностика инфекционных заболеваний в детском возрасте, так как метод безопасен.
Позволяет выявить возбудителя на любой стадии развития болезни.
Высокая чувствительность ПЦР позволяет обнаружить микобактерии туберкулёза, даже если в биологическом материале всего несколько микроорганизмов.
Хорошо его проводить для диагностики рецидива заболевания.

После всего прочитанного ПЦР кажется практически идеальным методом диагностики, который должны делать всем с подозрением на туберкулёз. Но и здесь есть свои минусы, их необходимо учитывать.

В наше время такая диагностика скорее редкость, чем закономерность. И для этого есть основания.

Это дорогой метод исследования. Во многих поликлиниках оборудование для проведения ПЦР отсутствует из-за высокой его стоимости, но в платных лабораториях анализ всё-таки можно сделать.
Сразу после проведённого лечения мёртвые микобактерии или живые в незначительном количестве могут ещё присутствовать в организме человека (при проведении ПЦР диагностики результат будет положительным), поэтому в это время метод будет недостоверным, проводить его нет смысла.
Мутации микобактерий приводят к неэффективности ПЦР — не может синтезироваться нормальная последовательность нити ДНК.
Нужно правильно выбирать среду для исследования, кровь берут только при подозрении на её заражение (сепсис), нет необходимости брать мокроту если под вопросом стоит туберкулёз органов нервной системы. В таком случае ПЦР не сможет обнаружить возбудителя и диагностика будет неинформативной.

ПЦР диагностика туберкулёза проводится чаще всего в спорных случаях. Когда врачи направляют на это исследование?

Если сложно поставить диагноз обычными доступными методами, но был контакт с больным туберкулёзом.
В случае, когда человека невозможно доставить на исследование в поликлинику для прохождения рутинных привычных исследований на туберкулёз, его легче обследовать с помощью ПЦР, так как мокроту для исследования можно доставить в баночке, а диагноз подтверждается в течение нескольких часов.
Если человеку предстоит экстренная операция и нужно срочно выяснить болен ли он туберкулёзом.
При необходимости беременную женщину тоже лучше обследовать на туберкулёз с помощью ПЦР, так как метод безопасен.
На платной основе диагностику может пройти каждый, у кого туберкулёз не был подтверждён с помощью бактериологических методов и рентгеноскопии. Такое бывает, когда очаг в лёгких незаметен на прямом снимке, а человек при сдаче мокроты на исследование не смог соблюсти рекомендации по правильному забору материала. При этом человека беспокоят все симптомы, характерные для туберкулёза лёгких.
Когда есть сомнения в результатах пробы Манту.
Предпочтительнее делать ПЦР диагностику туберкулёза у детей. Процедура безопасна, не создаёт дополнительную лучевую нагрузку, эффективна в отношении обнаружения сложных для диагностики форм заболевания.

Своевременная диагностика туберкулёза — это залог правильно назначенного лечения и снижения распространения заболевания. Часто знакомые методы выявления болезни не всегда эффективны. Поэтому ПЦР на сегодня является одним из самых достоверных и безопасных способов обнаружения инфекции на ранних этапах её развития.

источник