Пцр диагностика туберкулеза у животных

Диагностические исследования при антропозоонозных инфекциях (на примере туберкулеза крупного рогатого скота)

Туберкулез – широко распространенное инфекционное заболевание человека и жи-вотных, вызываемое микобактериями туберкулезного комплекса (Mycobacterium tubercu-losis complex – MTBC). От больных туберкулезом животных могут заражаться люди, для них наиболее опасны Mycobacterium bovis (микобактерии туберкулеза бычьего). От лю-дей, больных туберкулезом, микобактериями туберкулеза человека – Mycobacterium tu-berculosis может заражаться крупный рогатый скот. Диагноз на туберкулез у крупного ро-гатого скота ставят на основании результатов аллергических, патолого-анатомических, гистологических и бактериологических исследований с учетом эпизоотологических данных и клинических признаков.

На современном этапе обеспечение эпизоотического благополучия сельскохозяйственных организаций по туберкулезу крупного рогатого скота (КРС) является одной из актуальных задач ветеринарной науки и практики. В Российской Федерации мероприятия по профилактике туберкулеза и по борьбе с ним проводятся в соответствии с санитарными и ветеринарными правилами «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных», утвержденными Госкомсанэпиднадзором и Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 июня 1996 года, и «Наставлением по диагностике туберкулеза животных», утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 ноября 2002 года [1]. Ключевым звеном в программе мероприятий по профилактике и ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота и по оздоровлению КРС служат «…систематические ди-агностические исследования животных, выделение из стад больных живот-ных или целых неблагополучных групп с последующим их убоем…» [4]. Диагноз «Туберкулез» устанавливается на основании результатов комплексных исследований (рис. 1)

Рис. 1. Схема комплексных исследований крупного рогатого скота на туберкулез

Мониторинг эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в административно-территориальных субъектах осуществляется согласно пункту 1.3 раздела 1 «Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации туберкулеза животных» [4].

Прижизненная диагностика туберкулеза у крупного рогатого скота проводится аллергическим методом.
Аллергический метод – внутрикожная туберкулиновая проба с применением Пурифиед Протеин Дериватив – туберкулина (ППД-туберкулин) для млекопитающих. Туберкулин вводят крупному рогатому скоту в середину шеи (рис. 2). Учет и оценку реакции на введение туберкулина проводят через 72 часа. Животных считают положительно реагирующими на туберкулин при утолщении кожной складки на 3 мм и более. Толщину кожной складки в месте введения туберкулина измеряют кутиметром, а полученный показатель сравнивают с толщиной кожной складки рядом с местом введения препарата [3, 4].

Рис. 2. Туберкулиновая проба у крупного рогатого скота [6]

Для дифференциации парааллергических реакций у крупного рогатого скота используется симультанная проба с одновременным применением двух туберкулинов – для млекопитающих и для птиц или туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ).

Симультанная проба проводится в том же порядке, что и туберкулиновая (рис. 3). Проба является групповой и дает возможность оценить ситуацию по туберкулезу лишь в целом по стаду или по группе (не менее 6 голов) обследуемых животных. Под достоверностью различия понимают такое различие в величине показателей интенсивности реакций на туберкулин и КАМ, которое дает возможность с уверенностью не менее чем на 95 % сделать заключение о состоянии по туберкулезу обследуемой группы животных [3].

Рис. 3. Симультанная аллергическая проба с использованием ППД-туберкулина и комплексного аллергена из атипичных микобактерий [11]

Офтальмопроба на туберкулез (глазной метод туберкулинизации).
Туберкулин в количестве 3–5 капель наносится на конъюнктиву нижнего века или на поверхность роговицы глаза животного. Проводится офтальмопроба двукратно с 5–6-дневным интервалом [2, 4, 5]. Результаты офтальмопробы оценивают через 6, 9, 12 и 24 часа после первого и через 3, 6, 9 и 12 часов после повторного введения туберкулина. Реакция считается положительной, если образуется гнойный или слизисто-гнойный секрет, который накапливается в конъюнктивальном мешке или вытекает в виде шнура из внутреннего угла глаза. Кратковременная гиперемия слизистых оболочек глаза и слезотечение с образованием небольшого количества слизистого секрета рассматриваются как отрицательная реакция [3].

Факторы, обуславливающие проявление неспецифических реак-ций на туберкулин у КРС
В многочисленных исследованиях было показано, что проявления неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота обусловлены многочисленными факторами внешней среды и индивидуальными особенностями организма животного [2, 3, 5]. Неспецифические реакции подразделяются на две основные группы: парааллергические и псевдоаллергические (см. таблицу).

Причины возникновения неспецифических реакций у крупного рогатого скота на введение туберкулина

Причиной возникновения неспецифических реакций у крупного рогатого скота на введение туберкулина могут служить:
1)несоблюдение трехнедельного интервала между туберкулинизацией и вакцинацией (в этот период происходит сенсибилизация организма, и здоровые животные дают положительную реакцию на туберкулин);
2)«человеческий фактор» (диагностические исследования про-водят профессионально не подготовленные лица; наруша-ется методика проведения туберкулинизации и т. д.).

Лабораторные методы диагностики туберкулеза КРС
К лабораторным методам диагностики туберкулеза относятся бакте-риологическое исследование, серологическое исследование и молеку-лярно-биологическое исследование.
Бактериологическое исследование проводится с целью выделения возбудителя туберкулеза (рис. 4).

Отбор проб биоматериалов для бактериологического исследования производят как от животных с клиническими признаками туберкулеза, так и от животных, вызывающих подозрение на туберкулез. Исследуют молоко, мокроту, мочу. От павших и убитых животных для исследования отбирают пораженные участки органов на границе со здоровой тканью и измененные лимфатические уз-лы.

Рис. 4. Культура Mycobacterium bovis. Среда роста Гельберга [10]

При наличии характерных для туберкулеза изменений исследуются портальные, предлопаточные, надвыменные, поверхностные паховые лимфатические узлы и фрагменты внутренних органов – легких, печени, почек.

Бактериологическое исследование биоматериалов на туберкулез за-нимает срок до 3 месяцев. Заболевание животных туберкулезом считается установленным в случаях выделения микобактерий туберкулеза бычьего или человеческого из материала от убитых животных [3, 4, 8].

Серологическое исследование на туберкулез проводится в реакции связывания комплемента (РСК).
РСК применяется в двух вариантах:
1) для обнаружения в сыворотке больного животного специфических антител к возбудителю туберкулеза;
2) для выявления и идентификации в исследуемом материале антигена возбудителя туберкулеза.

Проводят серологическое исследование в сельскохозяйственной ор-ганизации в случаях, предусмотренных пунктом 2.7 раздела 2 «Инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации туберкулеза животных», а именно «…в случаях выявления в благополучном по туберкулезу стаде (на ферме) крупного рогатого скота при плановом исследовании реагирующих на туберкулин животных…» [4].

Молекулярно-биологическое исследование на туберкулез.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является одним из высокочувствительных и специфичных методов диагностики туберкулеза. Чувствительность метода ПЦР – от 10 до 100 микроорганизмов в пробе (чувствительность микроскопического метода – от 103 до 105 микроорганизмов). В основе метода лежит амплификация специфических участков ДНК возбудителя, которые содержатся в исследуемой пробе. В настоящее время в лабораторной практике применяются тест-системы как для выявления ДНК конкретного вида, так и для дифференцирования видов, входящих в Mycobacterium tuberculosis complex: микобактерий человеческого вида (M. tuberculosis), бычьего вида (M. bovis) и вакцинного штамма микобактерий бычьего вида (M. bovis BCG). Для проведения анализа используют следующие образцы биопроб от крупного рогатого скота: цельную кровь, молоко, фарингеальные смывы, мочу, фекалии, носовую слизь и биопсийные материалы, в том числе лимфатические узлы [3].

Молекулярно-биологическое исследование позволяет значительно ускорить раннюю диагностику туберкулеза, дифференцировать пара- и псевдоаллергические реакции на туберкулин, снизить количество подозреваемых в заражении туберкулезом и подвергаемых диагностическому убою животных [4, 5].

Патолого-анатомические исследования
Для убоя с диагностической целью отбирают животных по результатам вышеизложенных методов исследования.
Патолого-анатомические изменения в организме больного туберкулезом животного зависят как от его возраста, так и от стадии инфекционного процесса.
В начальных стадиях инфекционного процесса туберкулы имеют вид серых полупрозрачных узелков размером от булавочной головки до чечевичного зерна. Затем они становятся мутными, приобретают бело-желтый цвет, заполняются некротизированной сухой творожистой массой. В легких туберкулезные очаги поражения чаще выделяются над плеврой по тупому краю органа (рис. 5).

Рис. 5. Легкое крупного рогатого скота при туберкулезном поражении тканей [9]

Молочная железа, печень, селезенка и почки у крупного рогатого скота поражаются обычно при генерализованном процессе. «Жемчужница» (туберкулезное поражение серозных покровов) регистрируется с одновременным поражением паренхиматозных органов и региональных лимфатических узлов (рис. 6).

Рис. 6. Туберкулезные поражения серозных покровов («жемчужница») и регионар-ных лимфатических узлов у теленка [7]

Гистологические исследования проводят для дифференциации туберкулезных патолого-анатомических изменений от сходных изменений, наблюдаемых при других заболеваниях, например для дифференциации от гранулем паразитарного и микотического происхождения. В положительных случаях в гистологических препаратах, окрашенных по Цилю – Нильсену, находят гранулемы с некротизированным центром, окруженные зоной эпителоидных, отдельных гигантских лимфоидных клеток и соединительно-тканной капсулой.

Вместо заключения
Осуществление плановых профилактических диагностических иссле-дований на туберкулез способствует снижению риска инфицирования людей туберкулезом, ограничению распространения возбудителя из очагов инфекции, раннему выявлению неблагополучных по туберкулезу населенных пунктов.

источник

Али Хусинович Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ)

Марина Станиславовна Калмыкова, к.в.н., доцент кафедры радиобиологии и вирусологии им. академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Елена Петровна Вангели, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов ВИЭВ

Нина Гавриловна Толстенко, к.в.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов

Анализ литературных данных и проведенных собственных исследований показывает, что при применении ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота разными исследователями были получены неоднозначные результаты. Поэтому до настоящего времени единого мнения о диагностической значимости ПЦР не имеется, и этот метод не нашел широкого применения в ветеринарной практике нашей страны и за рубежом более чем за 30-летний период изучения.

В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 2002 г., ПЦР применяют при постановке диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота в случаях, когда отсутствуют видимые изменения или возникают затруднения при определении характера патологоанатомических изменений. Также применяют и для определения видовой принадлежности выделенных микобактерий. Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в организме исследованного животного ДНК определенного вида возбудителя туберкулеза. Отрицательный результат указывает на отсутствие ДНК возбудителя туберкулеза в исследуемых образцах биоматериала от животных или выделенной культуры.

В соответствии с 24-ым изданием «Кодекса здоровья наземных животных МЭБ» от 2015 г., при туберкулезе крупного рогатого скота рекомендуемым тестом является внутрикожная туберкулиновая проба, т.е. ПЦР-метод не включен в число рекомендуемых и даже альтернативных тестов при диагностике микобактериальных инфекций КРС.

Тем не менее, ПЦР считается наиболее современным диагностическим тестом, позволяющим выявлять даже единичные клетки возбудителя многих инфекционных заболеваний, за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК. Тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаружить патогенные бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно. Это преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-системы, которая составляет около десяти бактериальных клеток, в то время как чувствительность иммунологических и бактериологических тестов колеблется в пределах 10 3 -10 6 клеток. Тест-системы ПЦР эффективны при диагностике труднокультивируемых, не ультивируемых и персистирующих форм бактерий. ПЦР-диагностикумы позволяют избегать сложности, связанной с неспособностью таких бактерий размножаться в лабораторных условиях.

К недостаткам, ограничивающим применение ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, многие авторы относят выявление ложноположительных и ложноотрицательных результатов, неспособность ПЦР дифференцировать жизнеспособных микобактерий от нежизнеспособных.

Кроме того, следует учитывать и тот факт, что при ПЦР-диагностике размножению подвергается не микобактерия, а только ее ДНК, причем даже не вся молекула, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя.

А.Х. Найманов и соавт. (2009, 2014) считают, что выделение возбудителя туберкулеза, тем более его ДНК, не может являться основанием для установления диагноза, так как, в соответствии с утвержденными нормативными документами, даже при выделении возбудителя необходимо доказать его патогенность на чувствительных к заражению лабораторных животных (из-за возможного наличия L-форм M. bovis и M. tuberculosis).

Следует отметить, что наличие L-форм микобактерий возбудителей туберкулеза является актуальной проблемой при установлении диагноза в благополучных хозяйствах и, особенно, при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по этому заболеванию хозяйствах.

В последние годы многими авторами было доказано, что микобактерии туберкулеза образуют L-формы, которые длительное время могут выживать в организме человека, животных и во внешней среде с сохранением способности реверсии в бактериальную клетку (З.Н. Кочемасова, 1970; И.Р. Дорожкова и соавт., 1984; В.С. Федосеев, 1983;И.Н. Рубцова, 1983; М.М. Гертман, 1988; А.С. Донченко и соавт., 1994, 2004; Е.А. Асташова и соавт., 1990; Н.П. Овдиенко и соавт., 1995; Ю.А. Макаров, 1997; Л.А. Таллер, 2003; Л.В. Галатова и соавт., 2004; Е.Ю. Секин, 2006).

И.А. Бакулов и соавт. (1980), В.П. Урбан (1980), В.С. Федосеев и соавт. (1981), В.Г. Ощепков и соавт. (2009) и др. указывают, что при проведении оздоровительных мероприятий возбудитель туберкулеза подвергается воздействию защитных сил организма хозяина и различных внешних факторов окружающей среды. В результате большинство микобактерий погибает, однако остается много поврежденных, но живых клеток, которые сохраняют способность к проникновению в организм животных и реверсии в исходную патогенную форму.

Известно, что L-формы M. bovis выявляются в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Так, Е.Ю. Секин (2006) при исследовании 223 проб из 16 хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу из объектов животноводческих помещений выявлял L-формы микобактерий в 53% случаев, т.е. даже чаще, чем в бактериальной форме.

В связи с широким распространением и выявлением L-форм микобактерий в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах возникает естественный вопрос: что делать в хозяйствах (особенно в благополучных), где выделяются L-формы M. bovis? Ведь мы не знаем и не можем знать, когда L-формы M. bovis будут (а может и не будут) реверсировать в бактериальную форму. Вопрос остается открытым. Тем более, что практические ветеринарные лаборатории L-формы не выделяют (т.к. эти микобактерии растут только на специальных питательных средах).

Дж. Уотсон (1978), Б. Альбертс и соавт. (1986) при электронной микроскопии и фотографировании установили, что снаружи бактерии окружены жесткой защитной оболочкой, состоящей из белков, полисахаридов и липидов. За оболочкой находится эластичная клеточная мембрана. Эта мембрана полупроницаемая и определяет, какие молекулы поступают в клетку или выходят из нее. Приблизительно одна пятая часть внутреннего объема клетки занята ДНК (ответственной за передачу генетической информации от одной клетки к другой), а также РНК, белками и малыми молекулами.

Поэтому, с учетом всех указанных противоречий и особенностей диагностики такой сложной болезни, как туберкулез крупного рогатого скота, мы считаем, что выявление только ДНК возбудителя не может быть основанием для установления диагноза. ДНК сохраняется неизменной у всех видов микобактерий, в том числе у «живых», «мертвых» и «раненых» (безоболочечных, измененных, дефективных) форм микобактерий.

В завершении публикации считаем целесообразным привести некоторые выдержки из статьи Б.И. Антонова (2002), которые, по нашему мнению, остаются актуальными и в настоящее время:

«Использование метода ПЦР в ветеринарии некоторые восприняли как панацею, позволяющую получить точный и однозначный ответ во всех случаях. Это глубоко ошибочное мнение возникло еще в 90-х годах прошлого века, когда ряд пропагандистов данного метода ориентировали практику на простоту, точность и безграничные возможности…Ветеринарная лабораторная диагностика инфекционных болезней – это целый комплекс различных методов, позволяющих поставить диагноз, на что иногда требуется значительное время – от нескольких суток до нескольких месяцев. И, несмотря на это, ни один из применяемых методов не может полностью заменить другие. В таком положении в настоящее время оказался и метод ПЦР. Поэтому необходимо четко определить место метода ПЦР в системе диагностики конкретной болезни, ситуаций, при которых целесообразно использовать данный метод и при которых этого делать не стоит; знать особенности данного метода, уметь интерпретировать его результаты и дать обоснованное толкование взаимосвязи ПЦР и других методов диагностики. Без этого невозможно успешное использование … ПЦР».

С учетом всего указанного мы завершаем свою публикацию следующим заключением.

Заключение: на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота диагностика должна быть комплексной, с использованием всех классических методов, а ПЦР-метод может использоваться как дополнительный лабораторный экспресс-метод.

ПЦР целесообразно использовать в целях индикации возбудителей туберкулеза и их дифференциации от других видов нетуберкулезных микобактерий, а также как дополнительный сигнальный экспресс-метод при исследовании биоматериала от убитых с диагностической целью животных.

1. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис [и др.] // Издательство «Мир». – Москва. – 1986. – 11.2.7. – 223 с.

2. Антонов Б.И. ПЦР и серологическая диагностика без знака равенства // Медицинский центр «Наследственность» / Н.Новгород. – 2002. – С. 8.

3. Асташова Е.А. Персистенция L-форм микобактерий туберкулеза в организме телят / Е.А. Асташова, А.М. Кадочкин, В.С. Суворов // Бюллетень ВИЭВ. – 1990. — № 73-74. – С. 58-60.

4. Галатова Л.В. Выделяемость L-форм микобактерий из биоматериала и объектов внешней среды в зоне Южного Урала / Л.В. Галатова, А.А. Петров // Ветеринарная патология. – 2004. — № 1-2. – С. 159-161.

5. Гертман М.Н. Биологические свойства L-форм Mycobacterium bovis: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / Мария Ивановна Гертман. – Москва, 2004. – 19 с.

6. Найманов А.Х. ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова, Е.П. Осипова // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций. – Омск. – 2009. – С. 133-140.

7. Найманов А.Х. Проблемы диагностики микобактериальных инфекций крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Е.П. Вангели [и др.] // Ветеринария. – 2014. — №6. – С. 3-8.

8. Ощепков В.Г. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий под действием физических и химических факторов / В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секин, Л.А. Таллер, А.С. Шевцов // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций. – Омск. – 2009. – С. 146-155.

9. Секин Е.Ю. L-трансформация микобактерий, свойства и способы культивирования L-форм: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / Евгений Юрьевич Секин. – Новосибирск. – 2006. – 18 с.

10. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена / Дж. Уотсон // Издательство «Мир». – Москва. – 1978. – 9.5.6. – 720 с.

источник

Полимеразная цепная реакция (далее ПЦР) — это высокоточный метод молекулярно-генетического исследования материла, который позволяет выявить у человека различные инфекционные заболевания и установить генотип возбудителя.

ПЦР для выявления различных заболеваний стала применяться в самом конце прошлого века. Первооткрывателем этого метода исследования является американский биохимик Кэри Муллис. Свое открытие он сделал в 1983 году. Но еще несколько лет понадобилось, чтобы доработать метод.

С помощью ПЦР-диагностики можно обнаружить фрагменты чужеродного ДНК в любой жидкой среде организма. На анализ могут быть взяты такие жидкости:

• Кровь.
• Слюна.
• Мокрота.
• Выделения из половых органов.
• Смывная жидкость бронхов.
• Желудочный сок.

Лечащий врач сам определяет, какую биологическую жидкость лучше взять на анализ при конкретном заболевании.

ПЦР-диагностика позволяет не только обнаружить микрофрагменты чужеродной ДНК, но и определить к какому конкретному виду она относится. То есть с помощью ПЦР можно не только точно установить возбудителя заболевания, но и выяснить к какому виду он принадлежит.

Процесс анализа ПЦР — очень сложный. Он состоит из нескольких этапов:

1. Сначала нужно обнаружить фрагменты вредоносной ДНК в предоставленном образце.
2. Копирование фрагмента ДНК. Маленького участка ДНК для анализа недостаточно, поэтому его копируют. Нуклеиновая кислота может копироваться в пробирке с помощью фермента полимеразы (вне живого организма). В пробирке образуется множество клонов, то есть происходит цепная реакция. Весь процесс происходит в три этапа под воздействием различных температур.
3. Когда генетического материала становится достаточно для исследования, тогда возбудитель определяется обычными методами.

Метод ПЦР очень точен и может выявить наличие любого возбудителя по небольшому фрагменту ДНК или РНК.

ПЦР-анализ на туберкулез является самым информативным методом диагностирования этого заболевания. Относительно туберкулеза этот метод позволяет не только установить наличие микобактерий в организме, но и определить к какому виду они принадлежат.

Результат ПЦР диагностики может быть простой и расширенный. В простом результате указывается только наличие/отсутствие микобактерии. Расширенный результат дает представление о дополнительных параметрах протекания заболевания. Правильно понять, что написано в результате анализа ПЦР может только фтизиатр.

ПЦР-диагностика туберкулеза не проводится всем без исключения. Это объясняется дороговизной реактивов и недоступностью проведения исследования в некоторых отдалённых районах (в таких местах пользуются другими методами диагностики).

Показаниями для проведения ПЦР-исследования являются:

• Длительный контакт с больным туберкулезом.
• Беременность. ПЦР крови на туберкулез является самым быстрым и безопасным методом для беременной женщины.
• Экстренная ситуация. Например, необходимость срочного оперативного вмешательства, при котором нужно точно установить наличие/отсутствие туберкулеза в организме.
• Аллергическая реакция на туберкулиновые пробы.
• ВИЧ-инфекция.
• Невозможность диагностирования заболевания другими способами, при наличии явных признаков туберкулеза.
• Неоднозначные симптомы, которые не позволяют создать четкую клиническую картину заболевания (болезни верхних дыхательных путей, сопровождающиеся большим количеством мокроты, кровохарканьем и пр.).

Метод ПЦР, при всей своей сложности и дороговизне, проводится и расшифровывается в течение нескольких часов. Что делает этот метод золотым стандартом при диагностике туберкулезной инфекции.

Забор материала — это первый этап при выполнении ПЦР-исследования. Для того, чтобы выполнить качественный анализ, нужно соблюдать определенные правила по сбору материла:

• Для ПЦР мокроты на туберкулез нужно тщательно провести туалет полости рта. Делать это нужно вечером и утром перед анализом. Все это время не есть. Вечером выпить муколитическое средство для лучшего отхождения мокроты.
• Перед сдачей крови на ПЦР нужно не употреблять пищу в течение 8 часов. Лучше всего производить забор крови утором натощак. Курить перед забором крови также нельзя. Кровь берется из вены на локтевом сгибе руки в стерильную пробирку. В эту же емкость добавляется антикоагулянт, чтобы кровь оставалась жидкой. Смешивать антикоагулянт с кровью нужно очень аккуратно, не делая резких движений. Если кровь была взята не в лабораторных условиях, то она должна быть предоставлена лаборанту до истечения пятичасового срока. Иначе результат может быть не точным.
• Моча собирается в стерильную емкость утром, до приема пищи. Перед сбором мочи необходим тщательный туалет промежности.
• Остальные виды жидкостей (смывы с бронхов, спинномозговая жидкость) может собрать только специалист в условиях стационара.
• Перед забором жидкостей на ПЦР-исследование запрещено принимать некоторые препараты (например, прием некоторых антибиотиков нужно прекратить за две недели до забора материала).
• Требования к лаборатории, в которой проводится забор анализов на ПЦР очень строгие. Лаборатория должна быть стерильна, чтобы не произошло перекрестное загрязнение материала. В этом случае результаты могут быть ложноположительными.

ПЦР-тест на туберкулез — высокоточный информативный анализ. И требования к его проведению крайне строгие. Чтобы анализ получился, нужно соблюдать регламент.

Для работы в ПЦР-лаборатории приглашаются специально обученные врачи: бактериологи, вирусологи, микробиологи. Все они прошли дополнительное обучение для работы на сложном оборудовании.

Лаборатория должна иметь лицензию на выполнение работ связанных с бактериологически-опасными вирусами и бактериями.

В самой лаборатории должны быть выделены такие рабочие зоны:

• Зона приемки и сортировки проб.
• Зона подготовки проб. В этом помещении выделяются нуклеиновые кислоты из образцов материала.
• Зона проведения реакционных проб.
• Зона для учета результатов и расшифровки анализов.

Все помещения располагают последовательно. Допуск в эти зоны разрешен только работающим там сотрудникам, которые при входе соблюдают правила личной защиты от бактерий и вирусов.

Лучше, если есть возможность расположить лабораторию в отдельно стоящем здании с собственной системой вентиляции.

В лаборатории соблюдаются стерильные условия работы, чтобы избежать перекрестного загрязнения проб. Даже если один фрагмент чужеродной ДНК попадет в исследуемый материал, ПЦР его размножит, и анализ получится ложноположительным.

В каждой зоне лаборатории имеется свой набор оборудования и посуды для проведения исследований. Также имеются свои холодильники, которые не могут быть использованы в других целях, кроме хранения материала конкретной зоны исследований.

Использованные расходные материалы и остатки биологического материала уничтожаются специальными способами, в соответствии с инструкциями.

ПЦР-тест на туберкулез имеет множество плюсов, которые делают этот метод диагностики все более востребованным:

• Срок проведения. Несмотря на сложность проведения анализа, он готовится намного быстрее других лабораторных методов диагностики туберкулеза (около пяти часов). Это свойство анализа ПЦР становится особенно важным, когда анализ необходимо провести экстренно.
• Анализ ПЦР абсолютно безопасен и может проводиться беременным женщинам и детям.
• ПЦР-исследование можно сделать, когда по каким-то причинам нельзя выполнить другие методы диагностики.
• С помощью ПЦР-диагностики можно провести исследование любой биологической жидкости на выбор. В некоторых случаях это имеет большое значение.
• Позволяет обнаружить возбудителя на любой фазе заболевания. Даже после проведенного лечения, сохранившиеся остатки ДНК мертвых микобактерий будут обнаружены.
• Высочайшая чувствительность этого метода позволяет обнаруживать в биологическом материале даже единичные фрагменты ДНК микроорганизмов.
• Метод ПЦР позволяет не только обнаружить присутствие заболевания, но и может определить генотип возбудителя, отличив его от похожих микроорганизмов.
• ПЦР-исследование очень эффективно при рецидивирующем течении заболевания.
• Благодаря высочайшей чувствительности, анализ ПЦР может распознать микобактерии в организме человека, когда он только недавно инфицировался туберкулезом, задолго до появления клинических симптомов.

Казалось бы, метод ПЦР-диагностики содержит в себе только плюсы, но это не так.

Минусы этого метода исследования тоже существенны. При выборе метода исследования туберкулеза это также стоит учитывать:

• Это дорогостоящий метод исследования. Для проведения ПЦР-диагностики нужна специально-оборудованная лаборатория. Оборудование для таких исследований стоит очень дорого, и не во всякой лаборатории оно имеется. В крайнем случае, можно обратиться в платную лабораторию.
• Сразу же после проведенного лечения метод ПЦР применять не рекомендуется. В крови пациента некоторое время сохраняется небольшое количество живых и мертвых микобактерий. Если провести анализ в этот период, он покажет ложноположительный результат.
• При мутациях микобактерий, анализ будет недостоверным, так как нормальная ДНК не сможет синтезироваться.
• Для ПЦР-исследования имеет значение правильный выбор биологической жидкости на анализ.
• Сверхчувствительность. Это тот случай, когда достоинство метода становится его недостатком. Если при проведении анализа в биологический материал каким-то образом попадет даже единичный фрагмент чужеродного ДНК, то ПЦР его размножит, и будет получен ложный результат.

ПЦР-лаборатория имеется только в крупных противотуберкулезных диспансерах и диагностических центрах.

Объясняется это высокой стоимостью оборудования и высокими требованиями к содержанию лаборатории (реактивы, обработка).

Медицинские чиновники не сильно переживают из-за отсутствия ПЦР-лаборатории в каком-то конкретном населенном пункте, поскольку анализы на туберкулёз можно провести другими методами (культивирование микобактерий, микроскопическое исследование).

Если в населённом пункте нет бесплатной ПЦР-лаборатории, пациент по желанию может обратиться в платное учреждение.

В последнее время ПЦР-диагностика занимает все более прочные позиции в диагностике туберкулеза и других заболеваний, отодвигая на задний план другие методы диагностики.

источник

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции

1.1. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

1.2. Методы прижизненной диагностики.

1.2.2. Аллергическое исследование.

1.2.3. Серологическое исследование.

1.3. Методы послеубойной (посмертной) диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. ^

1.3.1. Патологоанатомическое исследование. I ^

1.3.2. Бактериологическое исследование.

1.3.2.2. Культуральное исследование.

1.3.2.3. Биологическое исследование (биопроба).

1.4. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. ^з

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы исследования.

2.2. Результаты исследования.

2.2.1 .Сравнительная оценка тест-систем ПЦР.

2.2.2 Определение режима тепловой обработки лабораторной посуды для разрушения ДНК возбудителя туберкулеза.

2.2.3.Разработка метода деконтаминации биоматериала от животных с поверхности от возбудителя туберкулеза и его ДНК.

2.2.4.Сравнительная оценка в остром опыте микроскопического, кулыуралыюго, биологического, серологического, патологоанато-мического методов исследований и ПЦР для диагностики туберку леза у крупного рогатого скота.

2.2.4.1 .Прижизненная диагностика.

2.2.4.2 .Послеубойная диагностика. 85 2.2.6.Идентификация культур кислотоустойчивых микроорганизмов.

Введение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Суханов, Игорь Павлович, автореферат

Актуальность темы. Туберкулезом из сельскохозяйственных животных наиболее часто поражается крупный рогатый скот. Неблагополучные по туберкулезу хозяйства несут убытки, которые складываются из стоимости погибших от туберкулеза животных и выбракованных туш, пораженных органов, снижения удоев, качества молока, недополучения приплода и молока при преждевременной сдаче на убой выявленных больных коров, а также затрат на проведение противотуберкулезных мероприятий, ограничений хозяйственной деятельности и т.п. Больные животные представляют опасность для здоровья людей (12, 13, 44, 57).

Эта проблема до настоящего время актуальна для многих регионов России, в которой заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом составляет около 2% от имеющегося поголовья (1) и достигает 30% от общей инфекционной патологии у взрослых животных этого вида (27, 68).

В основу противотуберкулезных мероприятий в нашей стране положен комплекс мер, научно разработанных С.Н. Вышелесским совместно с В.Н. Матвеевым, дополненный и усовершенствованный П.П. Вишневским, М.К. Юсковцом . и др. (138).

В общей системе мер борьбы с туберкулезом наиболее важным звеном является своевременная и достоверная диагностика (133, 163,174). Вместе с тем, имеющиеся на ветеринарном вооружении тесты не в полной мере отвечают предъявляемым к ним, необходимым на сегодняшний день, требованиям. Многие из них весьма трудоемки и не отличаются достоверностью (133, 134, 185).

Основное в профилактике туберкулеза — разрыв контакта с источником инфекции, которым является больное животное. Поэтому своевременное выявление таких животных — главное звено противотуберкулезных мероприятий.

Особенностью туберкулеза, как одной из хронических инфекций, является преобладание латентных форм и случаев бактерионосительства (83, 85, 86). Случаи клинического проявления болезни у крупного рогатого скота возникают обычно лишь при длительном течении и особенно в неблагоприятных условиях его содержания и кормления. За это время, до обнаружения заболевания может произойти перезаражение значительной части поголовья скота (195, 196). Основой прижизненной диагностики туберкулеза является туберкулиновая проба (115,129, 153). Однако нередкими являются случаи проявления парааллергической реакции на туберкулин, вызываемые сенсибилизацией организма животных некоторыми атипичными микобактериями (17,42, 51, 52, 100). Такая ситуация может приводить к ошибочной диагностике с последующими неоправданными расходами на проведение специальных патологоанатомических, бактериологических и аллергических исследований. При послеубойном осмотре крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин, не всегда удается установить туберкулезные изменения во внутренних органах и тканях животных (83-86).

Лабораторные исследования на туберкулез проводятся в сроки до трех месяцев, а в некоторых случаях могут длиться до полугода и более. Кроме того, выявление инфекционного агента при туберкулезе может быть осложнено из-за наличия у бактерий ультрамелких и Ь- форм. На проведение таких исследований затрачивается до двух лет (71-73).

Сложность определения состояния стада по туберкулезу состоит еще и в том, что заболевание считается установленным при обнаружении характерных признаков болезни на секции или выделении возбудителя, но не может быть полностью исключено при отрицательных данных этих исследований, если в стаде есть животные, реагирующие на туберкулин.

В последние годы для диагностики ряда болезней предложена поли-яеразная цепная реакция, которая является высокочувствительным экспресс методом исследования (16, 40, 43, 45, 46, 74,82). Налажено производство тест — систем ПЦР, в т.ч. и для туберкулеза.

В то же время совсем не разработаны условия исследования на туберкулез: какой биоматериал, в каком виде и объеме необходимо исследовать в ПЦР и какая требуется предварительная подготовка этого материала для исключения возможности получения ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов ПЦР.

В связи с этим разработка метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР), применение этой реакции для индикации и идентификации возбудителя в пробах, который не может быть быстро выявлен по каким либо причинам (длительный срок и низкая эффективность исследования, невозможность определения Ь — форм микобактерий, сложность выявления клеток возбудителя в биоматериале без выраженных туберкулезных поражений), традиционными методами исследования, является актуальной проблемой и одним из важнейших направлений научных исследований по туберкулезу.

Цель исследований. Разработать метод диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1 .Провести испытание отечественных тест — систем ПЦР для индикации возбудителя туберкулеза в биоматериале.

2.Разработать методы разрушения ДНК возбудителя туберкулеза на поверхности биоматериала и лабораторной посуды.

3 .Испытать ПЦР для прижизненной диагностики туберкулеза у телят в эксперименте. Определить динамику появления и сохранения агглютининов в крови зараженных телят с помощью реакции агглютинации латекса (РАЛ).

4.Определить в остром опыте эффективность ПЦР при диагностике туберкулеза у животных в сравнении с традиционными методами исследования.

5.Разработать наставление по диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции.

Установлено, что разрушение ДНК М.Ьо^ на поверхности контами-нированного биоматериала происходит при четырехкратном фламбировании пробы.

Доказано, что воздействие концентрированным раствором перманга-ната калия и пергидроля с содержанием 30% перекиси водорода в течение соответственно 10 и 60 мин не разрушает ДНК М.Ьот.

Показано, что разрушение ДНК М.Ьот на поверхности лабораторной посуды достигается прогреванием ее при 180-200 °С в течение двух часов.

Выявлено, что для индикации ДНК М.Ьоу18 необходимо исследование в ПЦР гомогенизированного биоматериала.

Установлено раннее — от 5 до 23 суток появление возбудителя туберкулеза в носовой слизи после алиментарного заражения животных и возможность с помощью ПЦР выявления таких животных.

Установлена возможность локализации М.Ьот в миндалинах зараженных животных, что делает целесообразным включение этого органа в число проб для исследования на туберкулез.

Испытания показали, что имеются отечественные высококачественные тест-системы ПЦР для диагностики туберкулеза.

Разработаны методы отбора и обработки проб биоматериала от крупного рогатого скота для исследования на туберкулез методом ПЦР.

Сделан сравнительный анализ чувствительности и специфичности традиционных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и ПНР. Установлено, что ПЦР может быть использована для контроля благопо лучия животных по этой болезни путем регулярного исследования носовой слизи животных.

Установлено, что ПЦР высоко эффективна при идентификации и дифференциации возбудителя туберкулеза; по достоверности получаемого результата, а также скорости исследования во много раз превосходит культу-ральные и биологические методы идентификации M.bovis и М.tuberculosis.

На основании проведенных исследований разработано «Наставление по диагностике туберкулеза крупного рогатого скота с применением полиме-разной цепной реакции (ПЦР)», утвержденное Департаментом ветеринарии 23.02.99. Издан приказ Департаментом ветеринарии № 23 от 08.06.99. «О проведении широкого производственного испытания метода диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)», с использованием указанного наставления.

1 .Результаты испытания отечественных тест-систем ПЦР для диагностики туберкулеза.

2.Результаты разработки методов деконтаминации лабораторной посуды и поверхности биоматериала от ДНК M.bovis.

3 .Результаты диагностики туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции и реакции агглютинации латекса.

Заключение диссертационного исследования на тему «Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции»

1 .Исследованиями установлено, что имеются отечественные тест-системы ПЦР для диагностики туберкулеза, обладающие достаточно высокой чувствительностью и специфичностью. Эти тест-системы высокоэффективны для прижизненной диагностики туберкулеза, при идентификации и дифференциации М.Ьо\т8 и М.ШЬегси^з.

2.ПЦР может быть использована для контроля благополучия молодняка крупного рогатого скота по туберкулезу и выявления зараженных животных путем регулярных исследований носовой слизи животных.

При исследовании послеубойного материала ПЦР уступает по эффективности биологическому методу диагностики. Повышение чувствительности этой реакции может быть достигнуто увеличением количества исследуемых проб и гомогенизацией плотного биоматериала. Положительные результаты реакции наиболее часты при исследовании заглоточных, подчелюстных, сре-достенных и бронхиальных лимфатических узлов.

Культуральный метод исследования мало эффективен для прижизненной диагностики туберкулеза.

3.При механической контаминации лабораторной посуды и поверхности плотного биоматериала разрушение ДНК возбудителя обеспечивается прогреванием посуды при (180-200) °С в течение двух часов и при четырехкратном фламбировании биоматериала.

Насыщенный раствор перманганата калия и пергидроль с содержанием 30% перекиси водорода при воздействии соответственно 10 и 60 мин не обеспечивает разрушение фрагментов ДНК на поверхности биоматериала.

4.С помощью реакции агглютинации латекса возможно выявление противотуберкулезных антител в разные сроки после заражения животных.

1 .В лабораторию ПЦР — диагностики должен поступать гомогенизированный биоматериал, предварительно деконтаминированный от механического загрязнения ДНК М.Ьот.

2.ПЦР может быть использована для прижизненной диагностики туберкулеза молодняка крупного рогатого скота путем регулярного исследования носовой слизи животных.

3.На основании полученных результатов исследований составлено и утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23.02.99 «Наставление по диагностике туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)»

По результатам наших исследований издан приказ Департаментом ветеринарии № 23 от 08.06.99. «О проведении широкого производственного испытания метода диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)», с использованием указанного наставления.

Наши исследования показали, что ПЦР в настоящее время может быть использована в качестве основного метода прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота и как дополнительный метод при после

115 убойной диагностике болезни. Положительный результат ПЦР — анализа дол жен рассматриваться как основание для постановки диагноза на туберкулез.

Данный метод исследования требует проведения широких производственных испытаний, после чего можно будет сделать окончательный вывод о том какое место ПЦР займет в диагностики туберкулез крупного рогатого скота.

источник

ПЦР-исследование аллергенов, используемых в широкой ветеринарной практике при диагностике туберкулёза животных

Аспирант лаборатории микобактериозов ВИЭВ В.М.Калмыков

Научный руководитель, заведующий лабораторией микобактериозов ВИЭВ, профессор, д.в.н. А.Х.Найманов

Доцент кафедры ветеринарной вирусологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ, к.в.н. М.С.Калмыкова

Научный сотрудник ЦНИИЭ Е.А.Долгова

Научный сотрудник ЦНИИЭ М.В.Альварес Фигероа

В настоящее время мероприятия по профилактике и борьбе с туберкулёзом животных в России проводят в соответствии с санитарными и ветеринарными правилами «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных», утверждёнными Госкомсанэпиднадзором и Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 июня 1996 года и «Наставлениями по диагностике туберкулёза животных», утверждёнными Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 ноября 2002 года.

В соответствии с этими утверждённых нормативными документами, основным методом прижизненной диагностики туберкулёза крупного рогатого скота является внутрикожная проба с ППД-туберкулином для млекопитающих. В качестве дополнительных методов диагностики применяют глазную пробу, пальпебральную пробу, внутривенную пробу, симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (КАМ), а также симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц.

Симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и ППД-туберкулином для птиц применяют для дифференциации неспецифических реакций у крупного рогатого скота и свиней при первичной постановке диагноза. Кроме этого, для контроля за благополучием животных по туберкулёзу в стадах, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией животных микобактериями комплекса авиум-интрацеллюляре или атипичными микобактериями.

Симультанную пробу с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ применяют для диагностики туберкулёза крупного рогатого скота при первичной постановке диагноза, а также для контроля за благополучием хозяйств, где реакции на туберкулин обусловлены сенсибилизацией животных атипичными микобактериями.

В последние годы в доступной литературе появились работы некоторых исследователей (А.П. Лысенко с соавт., 1998; В.В. Власенко с соавт., 2003), указывающие, что в процессе изготовления туберкулина не происходит глубокой биологической очистки, так как технологический регламент не может обеспечить стерильность и специфичность препарата. Поэтому нельзя исключать возможность размножения адаптивных форм возбудителя туберкулёза, которые могут поступать с туберкулином в организм животных после многократных внутрикожных введений.

Противоположное мнение высказывают В.Е. Козлов, В.М. Безгин (2004, 2006), указывая, что в технологию изготовления туберкулинов включён тест на специфическую безвредность, поскольку таково общепринятое международное требование безопасности для туберкулиновых препаратов. Готовый препарат не содержит живых возбудителей туберкулёза. Туберкулин представляет собой очищенный протеин, так называемый ППД (PPD: Purified Protein Derivate – очищенный дериват белка) туберкулиногенных штаммов возбудителя туберкулёза бычьего вида.

Учитывая актуальность проблемы этой болезни в нашей стране и имеющиеся сомнения в качестве аллергенов для диагностики туберкулёза животных, целью нашей работы было провести культуральное и ПЦР-исследование ППД-туберкулина для млекопитающих, ППД-туберкулина для птиц и сухого очищенного комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ) производства «Курской биофабрики» в целях определения возможности выявления микобактерий и ДНК микобактерий.

В работе использованы «Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих» стандартный раствор, серия №3, контроль №3;«Туберкулин очищенный (ППД) для птиц», серия 15, контроль 15; «Аллерген сухой очищенный комплексный из атипичных микобактерий (КАМ)», серия 7, контроль 7. Для культурального исследования использовали питательные среды Левенштейна-Йенсена и ФАСТ-3Л. Для ПЦР-исследования использовали тест-системы «МТБ-КОМ-FRT» для амплификации участка ДНК Mycobacterium tuberculosis complex методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени, «АВИУМ» для выявления ДНК Mycobacterium avium с электрофоретической детекцией в агарозном геле. Секвенирование специфических последовательностей 16S рДНК и internal transcribed spacer [ITS] региона проводили в соответствии с алгоритмом типирования микобактерий, предложенным American Society for Microbiology. Постановку ПЦР и анализ результатов проводили на приборе RotorGene-6000 производства «CorbettResearch»(Австралия).

Для культурального и ПЦР-исследования использовали нативные растворы аллергенов, концентрат, полученный путём многократного центрифугирования каждого миллиграмма аллергенов при 12000 об/мин. в течение 15 минут с целью получения осадка, а также надосадочную жидкость (каждую пробу исследовали в трёх повторах).

Кроме того, для ПЦР-исследования были взяты смывы с поверхности питательных сред через 10, 30, 45 и 60 дней после посева аллергенов.

Культуральное исследование проводили путём посева каждой полученной пробы на 10 пробирок с питательной средой Левенштейна-Йенсена и на 10 пробирок со средой ФАСТ-3Л. Просмотр посевов проводили через каждые 3 – 5 дней в течение трёх месяцев.

Результаты проведённых исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты культурального и ПЦР-исследования аллергенов, применяемых при диагностике туберкулёза животных

источник