Али Хусинович Найманов, д.в.н., профессор, заведующий лабораторией микобактериозов ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (ВИЭВ)
Марина Станиславовна Калмыкова, к.в.н., доцент кафедры радиобиологии и вирусологии им. академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина ФГБОУ ВПО МГАВМиБ
Елена Петровна Вангели, к.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов ВИЭВ
Нина Гавриловна Толстенко, к.в.н., ведущий научный сотрудник лаборатории микобактериозов
Анализ литературных данных и проведенных собственных исследований показывает, что при применении ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота разными исследователями были получены неоднозначные результаты. Поэтому до настоящего времени единого мнения о диагностической значимости ПЦР не имеется, и этот метод не нашел широкого применения в ветеринарной практике нашей страны и за рубежом более чем за 30-летний период изучения.
В соответствии с «Наставлением по диагностике туберкулеза животных» от 2002 г., ПЦР применяют при постановке диагноза на туберкулез у крупного рогатого скота в случаях, когда отсутствуют видимые изменения или возникают затруднения при определении характера патологоанатомических изменений. Также применяют и для определения видовой принадлежности выделенных микобактерий. Положительный результат ПЦР свидетельствует о наличии в организме исследованного животного ДНК определенного вида возбудителя туберкулеза. Отрицательный результат указывает на отсутствие ДНК возбудителя туберкулеза в исследуемых образцах биоматериала от животных или выделенной культуры.
В соответствии с 24-ым изданием «Кодекса здоровья наземных животных МЭБ» от 2015 г., при туберкулезе крупного рогатого скота рекомендуемым тестом является внутрикожная туберкулиновая проба, т.е. ПЦР-метод не включен в число рекомендуемых и даже альтернативных тестов при диагностике микобактериальных инфекций КРС.
Тем не менее, ПЦР считается наиболее современным диагностическим тестом, позволяющим выявлять даже единичные клетки возбудителя многих инфекционных заболеваний, за счет многократного увеличения количества копий тестируемых специфических последовательностей ДНК. Тест-системы, основанные на принципе амплификации ДНК, позволяют обнаружить патогенные бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно. Это преимущество достигается за счет высокой чувствительности ПЦР-системы, которая составляет около десяти бактериальных клеток, в то время как чувствительность иммунологических и бактериологических тестов колеблется в пределах 10 3 -10 6 клеток. Тест-системы ПЦР эффективны при диагностике труднокультивируемых, не ультивируемых и персистирующих форм бактерий. ПЦР-диагностикумы позволяют избегать сложности, связанной с неспособностью таких бактерий размножаться в лабораторных условиях.
К недостаткам, ограничивающим применение ПЦР при диагностике туберкулеза крупного рогатого скота, многие авторы относят выявление ложноположительных и ложноотрицательных результатов, неспособность ПЦР дифференцировать жизнеспособных микобактерий от нежизнеспособных.
Кроме того, следует учитывать и тот факт, что при ПЦР-диагностике размножению подвергается не микобактерия, а только ее ДНК, причем даже не вся молекула, а только определенный фрагмент, являющийся маркером данного возбудителя.
А.Х. Найманов и соавт. (2009, 2014) считают, что выделение возбудителя туберкулеза, тем более его ДНК, не может являться основанием для установления диагноза, так как, в соответствии с утвержденными нормативными документами, даже при выделении возбудителя необходимо доказать его патогенность на чувствительных к заражению лабораторных животных (из-за возможного наличия L-форм M. bovis и M. tuberculosis).
Следует отметить, что наличие L-форм микобактерий возбудителей туберкулеза является актуальной проблемой при установлении диагноза в благополучных хозяйствах и, особенно, при проведении оздоровительных мероприятий в неблагополучных по этому заболеванию хозяйствах.
В последние годы многими авторами было доказано, что микобактерии туберкулеза образуют L-формы, которые длительное время могут выживать в организме человека, животных и во внешней среде с сохранением способности реверсии в бактериальную клетку (З.Н. Кочемасова, 1970; И.Р. Дорожкова и соавт., 1984; В.С. Федосеев, 1983;И.Н. Рубцова, 1983; М.М. Гертман, 1988; А.С. Донченко и соавт., 1994, 2004; Е.А. Асташова и соавт., 1990; Н.П. Овдиенко и соавт., 1995; Ю.А. Макаров, 1997; Л.А. Таллер, 2003; Л.В. Галатова и соавт., 2004; Е.Ю. Секин, 2006).
И.А. Бакулов и соавт. (1980), В.П. Урбан (1980), В.С. Федосеев и соавт. (1981), В.Г. Ощепков и соавт. (2009) и др. указывают, что при проведении оздоровительных мероприятий возбудитель туберкулеза подвергается воздействию защитных сил организма хозяина и различных внешних факторов окружающей среды. В результате большинство микобактерий погибает, однако остается много поврежденных, но живых клеток, которые сохраняют способность к проникновению в организм животных и реверсии в исходную патогенную форму.
Известно, что L-формы M. bovis выявляются в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах. Так, Е.Ю. Секин (2006) при исследовании 223 проб из 16 хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу из объектов животноводческих помещений выявлял L-формы микобактерий в 53% случаев, т.е. даже чаще, чем в бактериальной форме.
В связи с широким распространением и выявлением L-форм микобактерий в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах возникает естественный вопрос: что делать в хозяйствах (особенно в благополучных), где выделяются L-формы M. bovis? Ведь мы не знаем и не можем знать, когда L-формы M. bovis будут (а может и не будут) реверсировать в бактериальную форму. Вопрос остается открытым. Тем более, что практические ветеринарные лаборатории L-формы не выделяют (т.к. эти микобактерии растут только на специальных питательных средах).
Дж. Уотсон (1978), Б. Альбертс и соавт. (1986) при электронной микроскопии и фотографировании установили, что снаружи бактерии окружены жесткой защитной оболочкой, состоящей из белков, полисахаридов и липидов. За оболочкой находится эластичная клеточная мембрана. Эта мембрана полупроницаемая и определяет, какие молекулы поступают в клетку или выходят из нее. Приблизительно одна пятая часть внутреннего объема клетки занята ДНК (ответственной за передачу генетической информации от одной клетки к другой), а также РНК, белками и малыми молекулами.
Поэтому, с учетом всех указанных противоречий и особенностей диагностики такой сложной болезни, как туберкулез крупного рогатого скота, мы считаем, что выявление только ДНК возбудителя не может быть основанием для установления диагноза. ДНК сохраняется неизменной у всех видов микобактерий, в том числе у «живых», «мертвых» и «раненых» (безоболочечных, измененных, дефективных) форм микобактерий.
В завершении публикации считаем целесообразным привести некоторые выдержки из статьи Б.И. Антонова (2002), которые, по нашему мнению, остаются актуальными и в настоящее время:
«Использование метода ПЦР в ветеринарии некоторые восприняли как панацею, позволяющую получить точный и однозначный ответ во всех случаях. Это глубоко ошибочное мнение возникло еще в 90-х годах прошлого века, когда ряд пропагандистов данного метода ориентировали практику на простоту, точность и безграничные возможности…Ветеринарная лабораторная диагностика инфекционных болезней – это целый комплекс различных методов, позволяющих поставить диагноз, на что иногда требуется значительное время – от нескольких суток до нескольких месяцев. И, несмотря на это, ни один из применяемых методов не может полностью заменить другие. В таком положении в настоящее время оказался и метод ПЦР. Поэтому необходимо четко определить место метода ПЦР в системе диагностики конкретной болезни, ситуаций, при которых целесообразно использовать данный метод и при которых этого делать не стоит; знать особенности данного метода, уметь интерпретировать его результаты и дать обоснованное толкование взаимосвязи ПЦР и других методов диагностики. Без этого невозможно успешное использование … ПЦР».
С учетом всего указанного мы завершаем свою публикацию следующим заключением.
Заключение: на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота диагностика должна быть комплексной, с использованием всех классических методов, а ПЦР-метод может использоваться как дополнительный лабораторный экспресс-метод.
ПЦР целесообразно использовать в целях индикации возбудителей туберкулеза и их дифференциации от других видов нетуберкулезных микобактерий, а также как дополнительный сигнальный экспресс-метод при исследовании биоматериала от убитых с диагностической целью животных.
1. Альбертс Б. Молекулярная биология клетки / Б. Альбертс, Д. Брей, Дж. Льюис [и др.] // Издательство «Мир». – Москва. – 1986. – 11.2.7. – 223 с.
2. Антонов Б.И. ПЦР и серологическая диагностика без знака равенства // Медицинский центр «Наследственность» / Н.Новгород. – 2002. – С. 8.
3. Асташова Е.А. Персистенция L-форм микобактерий туберкулеза в организме телят / Е.А. Асташова, А.М. Кадочкин, В.С. Суворов // Бюллетень ВИЭВ. – 1990. — № 73-74. – С. 58-60.
4. Галатова Л.В. Выделяемость L-форм микобактерий из биоматериала и объектов внешней среды в зоне Южного Урала / Л.В. Галатова, А.А. Петров // Ветеринарная патология. – 2004. — № 1-2. – С. 159-161.
5. Гертман М.Н. Биологические свойства L-форм Mycobacterium bovis: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / Мария Ивановна Гертман. – Москва, 2004. – 19 с.
6. Найманов А.Х. ПЦР на современном этапе борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, М.С. Калмыкова, Е.П. Осипова // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций. – Омск. – 2009. – С. 133-140.
7. Найманов А.Х. Проблемы диагностики микобактериальных инфекций крупного рогатого скота / А.Х. Найманов, Н.Г. Толстенко, Е.П. Вангели [и др.] // Ветеринария. – 2014. — №6. – С. 3-8.
8. Ощепков В.Г. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий под действием физических и химических факторов / В.Г. Ощепков, Е.Ю. Секин, Л.А. Таллер, А.С. Шевцов // Современные проблемы диагностики и профилактики хронических зооантропонозных инфекций. – Омск. – 2009. – С. 146-155.
9. Секин Е.Ю. L-трансформация микобактерий, свойства и способы культивирования L-форм: автореф. дис. … канд. вет. наук: 16.00.03 / Евгений Юрьевич Секин. – Новосибирск. – 2006. – 18 с.
10. Уотсон Дж. Молекулярная биология гена / Дж. Уотсон // Издательство «Мир». – Москва. – 1978. – 9.5.6. – 720 с.
источник
А.Х. Найманов, доктор ветеринарных наук,
ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» (Москва)
Паратуберкулез (паратуберкулезный энтерит, болезнь Jonne) ― хроническая инфекционная болезнь животных, характеризующаяся поражением кишечника и мезентериальных лимфатических узлов, сопровождающаяся расстройством ЖКТ, прогрессирующим истощением до летального исхода.
Болезнь чаще регистрируют у жвачных животных. Из домашних жвачных, главным образом, у КРС молочного направления, овец, коз и верблюдов. Выделение возбудителя из организма зараженных особей происходит, в основном, с фекалиями, реже с мочой и молоком.
Возбудителя болезни впервые выделили Н.А. Johne и L. Frothingham в 1895 году из подвздошной кишки коровы, больной паратуберкулезом. В 1912 году T.W. Twort, G.Z Ingram изолировали возбудителя паратуберкулеза и назвали его Mycobacterium enteritidis chronicae bovis. В дальнейшем возбудитель болезни квалифицирован как Mycobacterium paratuberculosis, а затем как Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis (МАР). МАР на 99 % генетически родственны с Mycobacterium avium, но отличаются микобактин-зависимостью, то есть, растут на питательных средах, содержащих фактор роста (микобактин). В последние годы возбудитель паратуберкулеза отнесен к комплексу Mycobacterium avium – intracellulare.
Паратуберкулез КРС широко распространен в мире. По данным МЭБ, в начале XXI века заболевание регистрировали в 60 странах мира [1]. На начало 2012 года в Российской Федерации зарегистрировано 4 неблагополучных пункта по паратуберкулезу КРС: в Брянской области (1), Сахалинской (2), Удмуртской республике (1). Экономический ущерб от болезни обусловлен значительным снижением продуктивности животных: потерей молочной продуктивности, истощением, бесплодием и, как следствие, выбраковкой больного поголовья.
Паратуберкулез был и остается одной из сложно контролируемых и диагностируемых инфекций, так как инкубационный период длится от шести месяцев до 15 лет. При этом носители микобактерий могут не иметь клинических признаков болезни, но, периодически выделяя возбудителя во внешнюю среду, заражать восприимчивых животных. Некоторые авторы проблему паратуберкулеза сравнивают с верхушкой айсберга ― так называемый «айсберг–эффект», когда на один клинический случай приходится 15–20 инфицированных животных, у которых болезнь протекает в латентной форме. «Скрытость» инфекции, низкие специфичность и чувствительность методов диагностики, сложность выделения и культивирования микобактерий паратуберкулеза, а также отсутствие возможности воспроизведения болезни на лабораторных животных ― вот основные причины, затрудняющие постановку диагноза этого давно известного, но недостаточно изученного хронического заболевания.
Достижения в области молекулярной генетики привели к разработке новых подходов к обнаружению возбудителя в диагностическом материале. На протяжении последних лет широко используют молекулярные технологии для генотипирования и дифференциации возбудителей на уровне ДНК, в частности, ПЦР.
В зарубежной литературе имеются сообщения об успешном испытании ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС [2]. Чувствительность и специфичность ПЦР определяли исследованием фекалий и сывороток крови молочных коров штата Индиана (США). Результаты ПЦР сравнивали с результатами культурального метода на жидких и твердых питательных средах и ИФА. Авторы оценили ПЦР как более точный и экспрессивный метод идентификации МАР, рекомендуют его применять при установлении статуса стад в отношении паратуберкулеза и включить в программу борьбы с этой инфекцией.
В доступной отечественной литературе сведений о применении ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС мы не обнаружили. Поэтому, учитывая недостаточную изученность некоторых важных вопросов диагностики, длительность, трудоемкость и сравнительно низкую эффективность классических методов прижизненной и лабораторной диагностики, изучение возможности применения метода ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС является вполне своевременным и актуальным.
Определить возможность применения ПЦР при диагностике паратуберкулеза КРС.
Исследования по диагностике паратуберкулеза КРС проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных», утвержденного Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 05.01.2001 г., № 13-5-02/0050.
Для ПЦР–исследования проб фекалий от коров использовали тест-системы «ПАРАТУБ» и «АВИУМ».
Базой для исследования послужило хозяйство, где были выявлены животные, подозреваемые в заражении паратуберкулезом. В 2010 году были выявлены коровы с длительной диареей и, как следствием этого, незначительным истощением и потерей молочной продуктивности.
В соответствии с представленными актами диагностических исследований, проведенных местной ветеринарной службой, и экспертизами лабораторных исследований, в декабре 2010 года межрайонной ветеринарной лабораторией при бактериологическом исследовании проб фекалий от пяти первотелок в двух пробах обнаружен возбудитель паратуберкулеза. В целях уточнения диагноза проведен комиссионный диагностический убой двух коров, у которых результаты бактериоскопии указали на паратуберкулез. При патолого-анатомическом исследовании не обнаружено изменений, характерных для паратуберкулеза. От убитых коров выделена культура возбудителя паратуберкулеза.
В марте 2011 года проведен комиссионный осмотр 404 голов КРС. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не обнаружено. В апреле исследовано 408 проб сыворотки крови коров методом РСК. Выявлено пять животных с положительным и одну особь с сомнительным результатом РСК. В апреле 2011 года все шесть животных были исследованы аллергической внутрикожной пробой с использованием ППД-туберкулина для птиц. Реагирующих не выявлено. В тот же период сыворотка крови от этих животных повторно была исследована в РСК. При повторном исследовании было получено только три положительных результата.
По результатам исследований проведен диагностический убой одной коровы с положительными результатами РСК. При патолого-анатомическом исследовании не обнаружено изменений, характерных для паратуберкулеза. При бактериологическом исследовании патматериала от убитой коровы возбудитель паратуберкулеза не выделен. Однако при бактериоскопическом исследовании патматериала обнаружены кислото- спиртоустойчивые палочки, расположенные полисадом, кучками и давшие основание предполагать наличие возбудителя паратуберкулеза.
В мае 2011 года проведен комиссионный клинический осмотр всего поголовья КРС хозяйства. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не обнаружено.
В связи с сомнениями и сложностью установления диагноза на паратуберкулез, дальнейшие исследования проводили комиссионно, совместно с сотрудниками лаборатории микобактериозов ВИЭВ.
В августе 2011 года в комплексе, где выявлялись подозреваемые в заражении паратуберкулезом животные, проведены комиссионный клинический осмотр поголовья и учет аллергических реакций на внутрикожное введение ППД-туберкулина для птиц. Животных с клиническими признаками паратуберкулеза не выявлено. При учете аллергических реакций через 72 часа после введения туберкулина для птиц реагирующих также не выявлено.
От животных этого комплекса были отобраны 32 пробы фекалий для ПЦР-исследования в ВИЭВ на наличие возбудителя паратуберкулеза. При исследовании ДНК МАР и ДНК M. avium не выделено.
Кроме того, при посещении диагностического центра и беседе с сотрудниками установлено, что при бактериологическом исследовании патматериала от убитых (подозреваемых в заражении паратуберкулезом) животных посевы проводили на обычные питательные среды, используемые для диагностики туберкулеза, без добавления фактора роста (экстракта из M. phlei). В связи с тем, что возбудитель паратуберкулеза в первых генерациях растет и размножается на питательных средах только в присутствии фактора роста, для идентификации выделенных культур микобактерий необходимо было эти культуры посеять на питательные среды с фактором роста и без него. К сожалению, это важное условие идентификации культур микобактерий и диагностики паратуберкулеза не было выполнено. Поэтому выделенные культуры нетуберкулезных (атипичных) микобактерий были ошибочно охарактеризованы как M. paratuberculosis.
Следует указать, что в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза (паратуберкулезного энтерита) животных» от 2001 года, диагноз на паратуберкулез считается установленным при наличии у животного характерных клинических признаков болезни и получения одновременно положительного результата бактериоскопического или гистологического исследования биоматериала от этих животных; при обнаружении характерных патолого-анатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах животных с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением болезни, независимо от наличия или отсутствия клинических признаков заболевания.
Анализ всей ранее проведенной диагностической работы, а также комиссионных диагностических исследований показывает отсутствие в стаде животных с характерными клиническими признаками паратуберкулеза, а также характерных патолого-анатомических изменений в кишечнике и мезентериальных лимфатических узлах с гистологическим или бактериоскопическим подтверждением. Кроме того, ранее выделенные кислото-спиртоустойчивые микобактерии и культуры микобактерий не идентифицированы как M. paratuberculosis, а из фекалий подозреваемых в заболевании паратуберкулезом животных ПЦР-исследованием не выделено ДНК МАР и ДНК M. avium.
В связи со сложностью диагностики паратуберкулеза, диагностические исследования необходимо проводить в соответствии с «Наставлением по диагностике паратуберкулеза» в комплексе с современными дополнительными методами исследований. Обнаружение в патматериале или фекалиях кислото-спиртоустойчивых палочек указывает на наличие микобактерий, но не является основанием для установления диагноза на паратуберкулез. При бактериологическом исследовании патматериала на это заболевание необходимо использовать специальные питательные среды с добавлением фактора роста (микобактин). В комплексе диагностических исследований ПЦР-анализ фекалий коров, подозреваемых в заражении паратуберкулезом, представляет собой эффективный дополнительный тест для подтверждения или исключения заражения животных M. paratuberculosis.
В комплекс методов диагностики паратуберкулеза КРС необходимо включить ПЦР-анализ фекалий животных, подозреваемых в заражении паратуберкулезом, для выявления ДНК МАР.
1. Шуляк Б.Ф. 110 лет со дня открытия возбудителя паратуберкулёза // Российский ветеринарный журнал. Сельскохозяйственные животные, 2005; 9: 238―239.
источник
Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему: Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции
1.1. Методы диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.
1.2. Методы прижизненной диагностики.
1.2.2. Аллергическое исследование.
1.2.3. Серологическое исследование.
1.3. Методы послеубойной (посмертной) диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. ^
1.3.1. Патологоанатомическое исследование. I ^
1.3.2. Бактериологическое исследование.
1.3.2.2. Культуральное исследование.
1.3.2.3. Биологическое исследование (биопроба).
1.4. Полимеразная цепная реакция в диагностике туберкулеза крупного рогатого скота. ^з
2. Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы исследования.
2.2. Результаты исследования.
2.2.1 .Сравнительная оценка тест-систем ПЦР.
2.2.2 Определение режима тепловой обработки лабораторной посуды для разрушения ДНК возбудителя туберкулеза.
2.2.3.Разработка метода деконтаминации биоматериала от животных с поверхности от возбудителя туберкулеза и его ДНК.
2.2.4.Сравнительная оценка в остром опыте микроскопического, кулыуралыюго, биологического, серологического, патологоанато-мического методов исследований и ПЦР для диагностики туберку леза у крупного рогатого скота.
2.2.4.1 .Прижизненная диагностика.
2.2.4.2 .Послеубойная диагностика. 85 2.2.6.Идентификация культур кислотоустойчивых микроорганизмов.
Введение диссертации по теме «Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология», Суханов, Игорь Павлович, автореферат
Актуальность темы. Туберкулезом из сельскохозяйственных животных наиболее часто поражается крупный рогатый скот. Неблагополучные по туберкулезу хозяйства несут убытки, которые складываются из стоимости погибших от туберкулеза животных и выбракованных туш, пораженных органов, снижения удоев, качества молока, недополучения приплода и молока при преждевременной сдаче на убой выявленных больных коров, а также затрат на проведение противотуберкулезных мероприятий, ограничений хозяйственной деятельности и т.п. Больные животные представляют опасность для здоровья людей (12, 13, 44, 57).
Эта проблема до настоящего время актуальна для многих регионов России, в которой заболеваемость крупного рогатого скота туберкулезом составляет около 2% от имеющегося поголовья (1) и достигает 30% от общей инфекционной патологии у взрослых животных этого вида (27, 68).
В основу противотуберкулезных мероприятий в нашей стране положен комплекс мер, научно разработанных С.Н. Вышелесским совместно с В.Н. Матвеевым, дополненный и усовершенствованный П.П. Вишневским, М.К. Юсковцом . и др. (138).
В общей системе мер борьбы с туберкулезом наиболее важным звеном является своевременная и достоверная диагностика (133, 163,174). Вместе с тем, имеющиеся на ветеринарном вооружении тесты не в полной мере отвечают предъявляемым к ним, необходимым на сегодняшний день, требованиям. Многие из них весьма трудоемки и не отличаются достоверностью (133, 134, 185).
Основное в профилактике туберкулеза — разрыв контакта с источником инфекции, которым является больное животное. Поэтому своевременное выявление таких животных — главное звено противотуберкулезных мероприятий.
Особенностью туберкулеза, как одной из хронических инфекций, является преобладание латентных форм и случаев бактерионосительства (83, 85, 86). Случаи клинического проявления болезни у крупного рогатого скота возникают обычно лишь при длительном течении и особенно в неблагоприятных условиях его содержания и кормления. За это время, до обнаружения заболевания может произойти перезаражение значительной части поголовья скота (195, 196). Основой прижизненной диагностики туберкулеза является туберкулиновая проба (115,129, 153). Однако нередкими являются случаи проявления парааллергической реакции на туберкулин, вызываемые сенсибилизацией организма животных некоторыми атипичными микобактериями (17,42, 51, 52, 100). Такая ситуация может приводить к ошибочной диагностике с последующими неоправданными расходами на проведение специальных патологоанатомических, бактериологических и аллергических исследований. При послеубойном осмотре крупного рогатого скота, реагировавшего на туберкулин, не всегда удается установить туберкулезные изменения во внутренних органах и тканях животных (83-86).
Лабораторные исследования на туберкулез проводятся в сроки до трех месяцев, а в некоторых случаях могут длиться до полугода и более. Кроме того, выявление инфекционного агента при туберкулезе может быть осложнено из-за наличия у бактерий ультрамелких и Ь- форм. На проведение таких исследований затрачивается до двух лет (71-73).
Сложность определения состояния стада по туберкулезу состоит еще и в том, что заболевание считается установленным при обнаружении характерных признаков болезни на секции или выделении возбудителя, но не может быть полностью исключено при отрицательных данных этих исследований, если в стаде есть животные, реагирующие на туберкулин.
В последние годы для диагностики ряда болезней предложена поли-яеразная цепная реакция, которая является высокочувствительным экспресс методом исследования (16, 40, 43, 45, 46, 74,82). Налажено производство тест — систем ПЦР, в т.ч. и для туберкулеза.
В то же время совсем не разработаны условия исследования на туберкулез: какой биоматериал, в каком виде и объеме необходимо исследовать в ПЦР и какая требуется предварительная подготовка этого материала для исключения возможности получения ложноположительных и ложноотрица-тельных результатов ПЦР.
В связи с этим разработка метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР), применение этой реакции для индикации и идентификации возбудителя в пробах, который не может быть быстро выявлен по каким либо причинам (длительный срок и низкая эффективность исследования, невозможность определения Ь — форм микобактерий, сложность выявления клеток возбудителя в биоматериале без выраженных туберкулезных поражений), традиционными методами исследования, является актуальной проблемой и одним из важнейших направлений научных исследований по туберкулезу.
Цель исследований. Разработать метод диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:
1 .Провести испытание отечественных тест — систем ПЦР для индикации возбудителя туберкулеза в биоматериале.
2.Разработать методы разрушения ДНК возбудителя туберкулеза на поверхности биоматериала и лабораторной посуды.
3 .Испытать ПЦР для прижизненной диагностики туберкулеза у телят в эксперименте. Определить динамику появления и сохранения агглютининов в крови зараженных телят с помощью реакции агглютинации латекса (РАЛ).
4.Определить в остром опыте эффективность ПЦР при диагностике туберкулеза у животных в сравнении с традиционными методами исследования.
5.Разработать наставление по диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции.
Установлено, что разрушение ДНК М.Ьо^ на поверхности контами-нированного биоматериала происходит при четырехкратном фламбировании пробы.
Доказано, что воздействие концентрированным раствором перманга-ната калия и пергидроля с содержанием 30% перекиси водорода в течение соответственно 10 и 60 мин не разрушает ДНК М.Ьот.
Показано, что разрушение ДНК М.Ьот на поверхности лабораторной посуды достигается прогреванием ее при 180-200 °С в течение двух часов.
Выявлено, что для индикации ДНК М.Ьоу18 необходимо исследование в ПЦР гомогенизированного биоматериала.
Установлено раннее — от 5 до 23 суток появление возбудителя туберкулеза в носовой слизи после алиментарного заражения животных и возможность с помощью ПЦР выявления таких животных.
Установлена возможность локализации М.Ьот в миндалинах зараженных животных, что делает целесообразным включение этого органа в число проб для исследования на туберкулез.
Испытания показали, что имеются отечественные высококачественные тест-системы ПЦР для диагностики туберкулеза.
Разработаны методы отбора и обработки проб биоматериала от крупного рогатого скота для исследования на туберкулез методом ПЦР.
Сделан сравнительный анализ чувствительности и специфичности традиционных методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и ПНР. Установлено, что ПЦР может быть использована для контроля благопо лучия животных по этой болезни путем регулярного исследования носовой слизи животных.
Установлено, что ПЦР высоко эффективна при идентификации и дифференциации возбудителя туберкулеза; по достоверности получаемого результата, а также скорости исследования во много раз превосходит культу-ральные и биологические методы идентификации M.bovis и М.tuberculosis.
На основании проведенных исследований разработано «Наставление по диагностике туберкулеза крупного рогатого скота с применением полиме-разной цепной реакции (ПЦР)», утвержденное Департаментом ветеринарии 23.02.99. Издан приказ Департаментом ветеринарии № 23 от 08.06.99. «О проведении широкого производственного испытания метода диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)», с использованием указанного наставления.
1 .Результаты испытания отечественных тест-систем ПЦР для диагностики туберкулеза.
2.Результаты разработки методов деконтаминации лабораторной посуды и поверхности биоматериала от ДНК M.bovis.
3 .Результаты диагностики туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции и реакции агглютинации латекса.
Заключение диссертационного исследования на тему «Диагностика туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции»
1 .Исследованиями установлено, что имеются отечественные тест-системы ПЦР для диагностики туберкулеза, обладающие достаточно высокой чувствительностью и специфичностью. Эти тест-системы высокоэффективны для прижизненной диагностики туберкулеза, при идентификации и дифференциации М.Ьо\т8 и М.ШЬегси^з.
2.ПЦР может быть использована для контроля благополучия молодняка крупного рогатого скота по туберкулезу и выявления зараженных животных путем регулярных исследований носовой слизи животных.
При исследовании послеубойного материала ПЦР уступает по эффективности биологическому методу диагностики. Повышение чувствительности этой реакции может быть достигнуто увеличением количества исследуемых проб и гомогенизацией плотного биоматериала. Положительные результаты реакции наиболее часты при исследовании заглоточных, подчелюстных, сре-достенных и бронхиальных лимфатических узлов.
Культуральный метод исследования мало эффективен для прижизненной диагностики туберкулеза.
3.При механической контаминации лабораторной посуды и поверхности плотного биоматериала разрушение ДНК возбудителя обеспечивается прогреванием посуды при (180-200) °С в течение двух часов и при четырехкратном фламбировании биоматериала.
Насыщенный раствор перманганата калия и пергидроль с содержанием 30% перекиси водорода при воздействии соответственно 10 и 60 мин не обеспечивает разрушение фрагментов ДНК на поверхности биоматериала.
4.С помощью реакции агглютинации латекса возможно выявление противотуберкулезных антител в разные сроки после заражения животных.
1 .В лабораторию ПЦР — диагностики должен поступать гомогенизированный биоматериал, предварительно деконтаминированный от механического загрязнения ДНК М.Ьот.
2.ПЦР может быть использована для прижизненной диагностики туберкулеза молодняка крупного рогатого скота путем регулярного исследования носовой слизи животных.
3.На основании полученных результатов исследований составлено и утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 23.02.99 «Наставление по диагностике туберкулеза крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)»
По результатам наших исследований издан приказ Департаментом ветеринарии № 23 от 08.06.99. «О проведении широкого производственного испытания метода диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР)», с использованием указанного наставления.
Наши исследования показали, что ПЦР в настоящее время может быть использована в качестве основного метода прижизненной диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота и как дополнительный метод при после
115 убойной диагностике болезни. Положительный результат ПЦР — анализа дол жен рассматриваться как основание для постановки диагноза на туберкулез.
Данный метод исследования требует проведения широких производственных испытаний, после чего можно будет сделать окончательный вывод о том какое место ПЦР займет в диагностики туберкулез крупного рогатого скота.
источник
А.Х. Найманов, Н.П.Овдиенко, Н.П. Помыканов (ВИЭВ)
На современном этапе борьбы с туберкулёзом животных основой профилактических и оздоровительных мероприятий была и остаётся диагностика этой болезни. При диагностике туберкулёза крупного рогатого скота основным, массовым и общепринятым методом является внутрикожная проба с применением ППД-туберкулина для млекопитающих. Одной из наиболее важных проблем при диагностике является проблема неспецифических реакций на туберкулин. Актуальность этой проблемы увеличивается из года в год. Так, в настоящее время, в благополучных хозяйствах РФ выявляется в 5,3 раза больше реагирующих на туберкулин животных, чем в неблагополучных по туберкулёзу хозяйствах.
Массовые выявления неспецифических реакций на туберкулин приводят к убою большого количества здоровых животных, что увеличивает размеры экономического ущерба и вызывает сомнения в правильности диагностики туберкулёза утверждёнными методами.
Кроме того, туберкулёз КРС имеет важное социальное значение, так как возбудитель болезни может передаваться человеку и вызывать заболевание людей и, наоборот, животные могут заразиться от людей.
В последние годы в нашей стране увеличилась заболеваемость людей туберкулезом, резко сократилось поголовье животных в общественных хозяйствах и увеличилось поголовье крупного рогатого скота в индивидуальных хозяйствах. Поэтому, в настоящее время, всё более возрастает проблема диагностики туберкулёза крупного рогатого скота в индивидуальных хозяйствах.
Следует указать, что для индивидуальных хозяйств более характерны бесконтрольные перемещения животных, перевозки кормов и животноводческой продукции, бесконтрольная торговля продуктами животноводства (особенно мясом и молоком), и все эти указанные факторы усложняют проведение комплекса профилактических и оздоровительных мероприятий при туберкулезе.
Другой немаловажной особенностью, затрудняющей диагностику микобактериозов в индивидуальных хозяйствах, является совместное содержание и тесный контакт разных видов животных и птиц.
В связи с указанными особенностями, в последние годы увеличивается количество жалоб владельцев животных на необоснованный убой реагирующих особей, заводятся судебные дела между владельцами животных и ветеринарными специалистами.
Мероприятия по профилактике и борьбе с туберкулёзом проводятся в соответствии с Законом РФ «О ветеринарии», санитарными правилами СП 31.093-96 и ветеринарными правилами ВП 13.3.1325-96, утвержденными Госкомсанэпиднадзором РФ 31.05.96 г. и Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ от 18.06.96 г., «Наставлением по диагностике туберкулёза животных», утверждённым Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства РФ от 18. 11.2002 г.
К сожалению, в этих нормативных документах очень мало рекомендаций по диагностике туберкулёза крупного рогатого скота в индивидуальных хозяйствах. Поэтому в практических условиях диагностические исследования в индивидуальных хозяйствах граждан проводят, как и в общественных хозяйствах.
Известно, что диагностика туберкулеза КРС в общественных хозяйствах имеет свои специфические особенности. Главной особенностью является тот факт, что в общественных хозяйствах диагноз на туберкулёз ставится по группе животных, т.е. по стаду. Так, в соответствии с утверждёнными нормативными документами, при постановке диагноза на туберкулез из числа реагирующих на туберкулин животных проводят диагностический убой нескольких наиболее характерно реагирующих, с последующим патологоанатомическим и лабораторным исследованиями.
Симультанная проба с применением туберкулина для млекопитающих и комплексного аллергена из атипичных микобактерий (КАМ), которая широко применяется в ветеринарной практике для дифференциации аллергических реакций на туберкулин, также является групповой и даёт возможность ориентироваться в ситуации по туберкулёзу только по стаду или группе (не менее шести голов) исследуемых животных.
Поэтому, учитывая сложную эпидемическую и эпизоотическую ситуацию по туберкулёзу в нашей стране, недостаточную эффективность методов диагностики этой болезни у животных, совершенствование методов диагностики туберкулёза крупного рогатого скота в индивидуальных хозяйствах является весьма актуальным.
Работу провели в индивидуальных хозяйствах Стародубского района Брянской области.
Исследования на туберкулёз проводили в соответствии с санитарными и ветеринарными правилами «Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных» от 31.05.96 г., «Наставлением по диагностике туберкулёза животных» от 18.11.02 г.
В работе использовали ППД-туберкулины для млекопитающих, ППД-туберкулины для птиц и КАМ (комплексный аллерген из атипичных микобактерий) производства Курской биофабрики. Для внутрикожного введения туберкулинов использовали безыгольные иньекторы БИ-7.
Основными методами исследования крупного рогатого скота являлась внутрикожная и симультанная туберкулиновые пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ.
Аллергические исследования и убой реагирующих животных проводили комиссионно, с участием представителей районной станции по борьбе с болезнями животных и ветеринарных врачей хозяйств.
От убитых животных брали лимфатические узлы, кусочки паренхиматозных органов и кровь для дальнейшего лабораторного (бактериологического и биологического) исследования на туберкулёз.
Полученные в процессе работы цифровые показатели обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Достоверность различий между средними арифметическими определяли с помощью критерия Стьюдента (Шмидт В.М., 1984).
На начальном этапе провели изучение распространённости микобактериозов крупного рогатого скота в Стародубском районе Брянской области.
Стародубский район благополучен по туберкулёзу КРС общественного пользования. В индивидуальных хозяйствах ежегодно выявляются реагирующие на туберкулин животные и единичные случаи заболевания туберкулёзом крупного рогатого скота.
Исследования провели в индивидуальных хозяйствах шести населённых пунктов, где проживают больные туберкулёзом и где СЭС было установлено наибольшее распространение этой болезни среди людей (д. Олейниково, д. Красный посёлок, д. Зап. Халеевичи, д. Даревичи, д. Ломаковка, посёлок Десятуха).
При исследовании 1316 голов крупного рогатого скота в шести населённых пунктах было выявлено 12 (0,9%) реагирующих на туберкулин коров. Причём все реагирующие животные были выявлены в индивидуальных хозяйствах семей больных туберкулёзом людей. Из них в д. Олейниково при исследовании в 233 индивидуальных хозяйствах 273 голов крупного рогатого скота выявлено две (0,7 %) реагирующие коровы в одной семье. В д. Красный посёлок при исследовании в 167 индивидуальных хозяйствах 220 голов КРС выявлено четыре (1,8 %) реагирующие коровы в трёх семьях. В д. Зап. Халеевичи при исследовании в 156 индивидуальных хозяйствах 185 голов крупного рогатого скота выявлена одна (0,5%) реагирующая корова в одной семье. В д. Даревичи при исследовании в 102 индивидуальных хозяйствах 123 голов КРС выявлена одна (0,8 %) реагирующая корова в одной семье. В д. Ломаковка при исследовании в 58 индивидуальных хозяйствах 65 голов крупного рогатого скота выявлено четыре (6,2 %) реагирующие коровы в четырёх семьях. В посёлке Десятуха при исследовании в 338 индивидуальных хозяйствах 450 голов крупного рогатого скота реагирующих на туберкулин животных не выявили.
Суммируя полученные результаты исследований, можно сделать заключение, что все 12 реагирующих коров были выявлены в десяти индивидуальных хозяйствах. Это десять семей, в которых был зарегистрирован туберкулёз людей. В этих личных хозяйствах имелось 21 голова крупного рогатого скота, из них реагировало 12 (57,0 %) животных.
По результатам проведённых аллергических исследований 12 реагировавших коров подвергли диагностическому убою и патологоанатомическому осмотру.
При диагностическом убое этих особей характерные для туберкулёза изменения были обнаружены у одной коровы Красули в средостенном лимфатическом узле и лёгких. Двенадцатилетняя Красуля реагировала на внутрикожное введение туберкулина увеличением толщины кожной складки на 12 мм. Хозяин коровы Нешков А.С. стоит на учёте в туберкулёзном диспансере.
В остальных случаях у 11 реагировавших на туберкулин коров характерных для заболевания изменений не обнаружили.
В целях выяснения причины возникновения аллергических реакций у реагировавших на туберкулин животных мы провели бактериологические исследования патматериала от всех 12 убитых коров.
При лабораторном анализе положительный результат культуральных исследований и биологической пробы на морских свинках получен только при исследовании патматериала от коровы Красуля.
В остальных 11 случаях возбудителя туберкулёза не выделили. Из шести проб патматериала от убитых коров выделили атипичные микобактерии III и IV группы по классификации Раньона. Из пяти проб патматериала возбудителя туберкулёза и других видов микобактерий не выделили.
Проведённые исследования показывают, что основной причиной возникновения аллергических реакций на туберкулин является сенсибилизация животных атипичными микобактериями, а также возможное заражение туберкулёзом бычьего вида от больных людей (вследствие близкого, тесного и постоянного контакта больных туберкулёзом людей и животных).
По данным медицинской службы, в десяти семьях (в индивидуальных хозяйствах которых выделены реагирующие на туберкулин животные) было зарегистрировано 13 больных туберкулёзом людей. В связи с тем, что медицинской службой района не проводится определение вида возбудителя туберкулёза, все больные люди числятся инфицированными M. tuberculosis.
Однако следует отметить, что по результатам наших исследований у коровы Красуля были обнаружены характерные для туберкулёза изменения в средостенном лимфатическом узле и лёгких. Установленный факт позволяет нам считать, что корова заболела туберкулёзом бычьего вида.
Во время обследования людей обращали особое внимание на место и условия работы больных туберкулёзом. При этом установили, что трое больных работали на МТФ – один скотником, один сторожем и одна дояркой, т.е. имели прямой контакт со скотом общественного пользования.
Тем не менее, общественные хозяйства Стародубского района благополучны по туберкулёзу крупного рогатого скота. Однако при плановых аллергических исследованиях по заболеванию общественного поголовья КРС выявляются реагирующие на туберкулин животные, при диагностическом убое которых не подтверждается наличие туберкулёза, но выделяются атипичные микобактерии III и IV группы по классификации Раньона.
В доступной литературе мы не нашли данных о видовом составе выделяемых микобактерий в Стародубском районе Брянской области. Поэтому мы провели исследования по выделению и изучению видового состава микобактерий, выделенных от убитых с диагностической целью животных и объектов внешней среды.
Исследования провели в индивидуальных хозяйствах шести деревень Стародубского района Брянской области. Ранее проведённым анализом было установлено, что в этих населённых пунктах при плановых аллергических исследованиях на туберкулёз периодически выявляются реагирующие на туберкулин животные с неспецифическими реакциями.
Пробы объектов внешней среды брали в каждом индивидуальном хозяйстве, где были выявлены реагирующие на туберкулин животные: из кормушек, с пола, из навоза, почвы дворов (поверхность и глубина 0-10 см). Образцы проб подвергали деконтаминации 6-10% раствором серной кислоты, обработку проб проводили по методу Аликаевой. Все посевы и их дальнейшую обработку, инкубацию, изучение свойств выделенных культур проводили по общепринятой методике.
При исследовании объектов внешней среды были выделены различные виды микобактерий. Так, из проб соскобов из кормушек выделили культуры атипичных микобактерий в трёх случаях (одна культура микобактерий – III группы по классификации Раньона и две культуры атипичных микобактерий – IV группы по классификации Раньона). Из проб соскобов с пола выделены культуры быстрорастущих атипичных микобактерий в двух случаях (IV группы по классификации Раньона). Из проб навоза выделили культуры атипичных микобактерий в трёх случаях (одна культура – III группы и две культуры – IV группы по классификации Раньона). Из проб почвы дворов (поверхность) выделили культуры быстрорастущих атипичных микобактерий в трёх случаях (IV группы по классификации Раньона). Из проб почвы дворов (глубина 5-10 см) выделили культуры атипичных микобактерий в пяти случаях (две культуры – III группы и три культуры быстрорастущих атипичных микобактерий – IV группы по классификации Раньона.
Следующей задачей наших исследований было изучить возможность применения симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ с индивидуальным учётом проявления реакций на разные аллергены.
Исследования провели в трёх населённых пунктах Стародубского района Брянской области (с. Бучки, с. Шняки, с. Горный). В указанных пунктах при исследовании крупного рогатого скота на туберкулёз ранее регулярно выявлялись реагирующие на туберкулин животные, которых впоследствии сдавали на убой. Проведёнными патологоанатомическими и лабораторными исследованиями наличие туберкулёза у реагирующих на туберкулин животных не подтверждается. По данным СЭС, туберкулёз людей в этих сёлах не регистрируется.
В с. Бучки провели исследование симультанной туберкулиновой пробой 320 коров индивидуальных хозяйств. При учёте реакции выявлено 26 (8,1 %) реагирующих животных.
По результатам исследований, на 26 реагирующих животных вначале провели определение достоверности реакции по группе реагирующих коров (групповой учёт), затем индивидуальный учёт проявления аллергических реакций на разные аллергены.
При групповом учёте симультанной туберкулиновой пробы выявили реагирующих с большей интенсивностью реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих, т.е. со знаком (+), – одну корову; с меньшей реакцией, т.е. со знаком (-), – 17 коров, с равной реакцией, т.е. со знаком (=), – одну корову; с реакциями, не подлежащими учёту при групповом учёте, т.е. со знаком (?), – 7 коров.
При индивидуальном учёте реакций из 26 реагирующих на туберкулин коров реагировали с большей интенсивностью реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих, т.е. со знаком (+), – одна корова Ромашка, с меньшей реакцией т.е. со знаком (-), – 22 коровы; с равной реакцией, или со знаком (±), – три коровы. При диагностическом убое Ромашки, реагирующей на ППД-туберкулин для млекопитающих на 9 мм, на КАМ – 4 мм, характерных для туберкулёза изменений не обнаружили. При лабораторном исследовании патматериала от убитой особи возбудителя туберкулёза не выделили.
Полученные результаты исследований показывают, что, при исследовании крупного рогатого скота индивидуальных хозяйств с. Бучки, из 26 реагирующих животных при индивидуальном учёте реагировали положительно – одна корова, отрицательно – 22 коровы, сомнительно – три коровы. То есть, в результате применения симультанной туберкулиновой пробы и индивидуального учёта аллергических реакций по предлагаемой нами методике, диагностическому убою подлежит только одна корова, три коровы подлежат переисследованию другими методами диагностики, а 22 (84,6 %) реагирующих коровы следует считать здоровыми.
В индивидуальных хозяйствах с. Шняки провели исследование 210 голов крупного рогатого скота. При учёте реакции выявили 48 (22,8 %) реагирующих на разные аллергены животных.
При групповом учёте симультанной туберкулиновой пробы в с. Шняки выявили реагирующих с большей интенсивностью реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих, т.е. со знаком (+), – восемь коров; с меньшей реакцией, т.е. со знаком (-), – восемь коров; с равной реакцией, т.е. со знаком (=), – 13 коров; с реакциями, не подлежащими учёту при групповом исследовании, т.е. со знаком (?), – 19 коров.
Полученные результаты показывают, что при анализе реакций в соответствии с «Наставлениями по диагностике туберкулёза животных», т.е. при групповом учёте реакций, 19 (39,6 %) коров как бы выпадают из числа реагирующих животных, и в дальнейшем неизвестно, что делать с ними. Тем более, что в индивидуальных хозяйствах необходимо решать судьбу каждой коровы в отдельности. Результаты исследований убеждают, что в индивидуальных хозяйствах необходимо применять индивидуальный учёт аллергических реакций.
При индивидуальном учёте аллергических реакций из 48 реагирующих животных реагировало с большей интенсивностью реакции на ППД-туберкулин для млекопитающих, т.е. со знаком (+), – восемь коров, с меньшей реакцией, т.е. со знаком (-), – 24 коровы, с равной реакцией, т.е. со знаком (=), – 16 коров.
По результатам проведённых исследований в с. Шняки осуществили диагностический убой семи коров, реагирующих с большей интенсивностью на ППД для млекопитающих. При патологоанатомическом осмотре убитых особей характерных для туберкулёза изменений не обнаружили ни в одном случае. При лабораторном исследовании патматериала от убитых коров возбудителя туберкулёза не выделили.
В с. Горный провели исследование симультанной туберкулиновой пробой 275 голов крупного рогатого скота. При учёте реакции выявили 16 (5,8 %) реагирующих на разные аллергены животных.
При групповом учёте аллергических реакций выявили реагирующих с большей интенсивностью на ППД-туберкулин для млекопитающих, т.е. со знаком (+), – четыре коровы; с меньшей реакцией, т.е. со знаком (-), – пять коров; с равной реакцией, т.е. со знаком (=), – реагирующих коров не выявили; с реакциями, не подлежащими групповому учёту, т.е. со знаком (?), – семь коров.
При индивидуальном учёте аллергических реакций из 16 реагирующих животных, реагировали с большей интенсивностью на ППД-туберкулин для млекопитающих, т.е. со знаком (+), – три коровы; с меньшей реакцией, т.е. со знаком (-), – 12 коров; с равной реакцией, т.е. со знаком (=), – одна корова.
По результатам исследований в с. Горный провели диагностический убой четырёх реагирующих на туберкулин коров. При патологоанатомическом осмотре убитых животных характерных для туберкулёза изменений не обнаружили. При лабораторном исследовании патматериала от убитых коров возбудителя туберкулёза не выделили.
Суммируя результаты исследований в индивидуальных хозяйствах трёх населённых пунктов, мы установили, что при исследовании 605 голов крупного рогатого скота было выявлено 80 (13,2 %) реагирующих на симультанную туберкулиновую пробу коров. При индивидуальном учёте результатов симультанной пробы по предлагаемой нами методике учёта аллергических реакций выявили 13 (2,1 %) положительно реагирующих, 51 (8,4 %) отрицательно реагирующих и 26 (4,3 %) сомнительно реагирующих коров, т.е. в конечном итоге положительные показания по симультанной туберкулиновой пробе были получены только у 13 (2,1 %) животных.
На основании проведённых исследований и полученных результатов считаем, что при проведении симультанной пробы ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ в индивидуальных хозяйствах, учёт результатов симультанной туберкулиновой пробы следует проводить индивидуально, по каждой корове. При индивидуальном учёте симультанной пробы следует считать за положительную реакцию – животных с большей интенсивностью аллергических реакций (не менее 2 мм) на ППД-туберкулин для млекопитающих, за отрицательную реакцию – реагирующих с большей интенсивностью аллергических реакций (не менее 2 мм) на КАМ, за сомнительную реакцию – реагирующих животных с равной реакцией (не больше 2 мм) на ППД-туберкулин для млекопитающих и КАМ.
Считаем, что при исследовании симультанной туберкулиновой пробой крупного рогатого скота в индивидуальных хозяйствах нет никакой необходимости определять достоверность проявления реакций по группе животных. Главная же цель исследований – как и на какой аллерген реагирует каждая корова в отдельности. Кроме того, при учёте симультанной пробы необходимо учитывать все реакции, по каждой реагирующей корове (в т. ч. реагирующих только на КАМ) с критериями оценки аллергических реакций; + (положительно), — (отрицательно), = (сомнительно).
Предлагаемая нами методика учёта аллергических реакций симультанной туберкулиновой пробы с индивидуальным учётом аллергических реакций вполне вписывается в рамки требований унифицированных методов диагностики туберкулёза в странах Европейского союза, так как в этих странах применяется только индивидуальный учёт результатов симультанной туберкулиновой пробы с примерно такими же критериями оценки аллергических реакций.
1. В населённых пунктах, где установлено заболевание туберкулёзом людей, при плановых аллергических исследованиях крупного рогатого скота индивидуальных хозяйств выявляются реагирующие на туберкулин животные. При диагностическом убое и лабораторном исследовании биоматериала от реагирующих животных подтверждается наличие туберкулёза или выделяются атипичные микобактерии III и IV группы по классификации Раньона.
2. При применении симультанной пробы с ППД-туберкулином для млекопитающих и КАМ в индивидуальных хозяйствах учёт результатов симультанной пробы следует проводить индивидуально по каждому реагирующему животному.
3. При индивидуальном учёте симультанной пробы следует считать: за положительную реакцию – реагирующих животных с большей интенсивностью реакций на ППД-туберкулин для млекопитающих; за отрицательную реакцию – реагирующих с большей интенсивностью реакций на КАМ или ППД-туберкулин для птиц; за сомнительную реакцию – реагирующих животных с равной реакцией (с разницей не больше 2 мм) на разные аллергены.
источник