Определение состояния основных систем иммунитета, их клеточных структур, а также оценка степени развития специфических иммунологических реакций могут помогать в решении ряда задач в клинике туберкулеза. Анализ результатов иммунологического обследования позволяет оценить активность течения туберкулезного процесса и, что особенно важно, минимальную активность в случаях выявления ограниченных специфических поражений. С помощью иммунологических тестов удается определить характер течения заболевания, направление его динамики в сторону прогрессирования или ликвидации поражений, в известной мере — прогноз возникновения обострений и рецидивов. Наблюдение в динамике позволяет осуществлять контроль эффективности проводимого лечения — как традиционного химиотерапевтического, так и с применением ряда патогенетических средств.
Уточнение иммунологического статуса больного может иметь значение и перед началом оперативного вмешательства, а также с целью назначения различных иммуностимулирующих препаратов в комплексном лечении больных туберкулезом Кроме того, учет иммунологических сведений может способствовать дифференциальной диагностике туберкулеза с другими заболеваниями легких, в основном подтверждая или не подтверждая диагноз туберкулеза, а по возможности конкретизируя диагноз другого легочного заболевания.
Иммунологические методы исследования используются также при попытках дифференцирования поствакцинальной и инфекционной аллергии; с их помощью осуществляется диагностика лекарственной непереносимости, возникающей в процессе химиотерапии, т. е. выявление лекарственного средства вызывающего подобные реакции.
В большинстве случаев при самых различных заболеваниях (включая и туберкулез) для оценки состояния иммунитета Сольных используется принципиально одинаковый набор иммунологических методов, включающий в себя тесты оценки состояния Т- и В-систем лимфоцитов, а также некоторых их субпопуляции (особенно регуляторных). Подобная оценка предусматривает количественную характеристику тех или иных им-мунокомпетентных клеток, а также определение их функциональной активности.
В комплекс иммунологического обследования, как правило, входят также методы оценки сенсибилизированных к соответствующим антигенам Т- и В-лимфоцитов или их продуктов — медиаторов и антител.
Ценную информацию могут предоставить исследования по обнаружению антигенов микобактерий или других микроорганизмов в таком наиболее доступном материале, как периферическая кровь. Однако эти методы пока не нашли широкого распространения, несмотря на отдельные положительные сообщения, и только в последнее время появились новые возможности по выявлению специфических антигенов в иммунных комплексах.
Кроме того, важное значение имеет определение факторов неспецифической реактивности, к которым относятся, например, различные компоненты системы комплемента и ряд других факторов. Широко используются также реакции определения функции фагоцитов: полинуклеаров и макрофагов, особенно альвеолярных, при легочных заболеваниях, а также различных сывороточных белков, гормонов и т. д. — с помощью иммунологических методов с применением антисывороток к этим веществам.
Как показали многочисленные исследования, при ряде заболеваний легких, особенно хронически протекающих, развиваются частичные, иногда преходящие иммунологические нарушения, которые могут влиять на течение болезни и эффективность лечения. При этом нарушения бывают связаны с какой-либо функцией иммунокомпетентных клеток или с той или иной субпопуляцией. Например, снижение реакции на один из митогенов при ее сохранении на другой или при нормальных количественных характеристиках лимфоцитов, нарушение деятельности какой-нибудь из субпопуляций лимфоцитов-хелперов или супрессоров при нормальной функции другой субпопуляции. В других случаях определение числа Т- и В-лимфоцитов необходимо для суждения об изменении тех же субпопуляций.
Оценка специфического иммунитета — наиболее признанный подход в использовании иммунологических методов в клинике. В этом направлении разработано большое количество клеточных и серологических реакций, применяемых для решения различных клинических задач с иммунологических позиций.
Развитие клинической иммунологии в последние годы связано с усовершенствованием методов исследования и появлением принципиально новых, позволяющих на качественно ином уровне определять популяции и субпопуляции иммунокомпетентных клеток (в частности, с помощью моноклональных антител), производить выделение и очистку специфических антигенов, определять антигены в биологических жидкостях. Все эти методы стали достаточно широко, но не в одинаковой степени применяться и при легочной патологии.
Основным и наиболее часто используемым материалом для исследования является кровь больного и клетки крови. Вместе с тем технические принципы постановки реакций являются в основном общими и при использовании других субстратов, содержащих иммунокомпетентные клетки или их продукты, исключая, конечно, методы их выделения. Следовательно, эти стандартные методики с той или иной долей необходимых изменений можно без очень больших трудностей перенести на исследование другого материала.
Тесты количественной и функциональной оценки Т-лимфоцитов и их субпопуляций. Розеткообразование с бараньими эритроцитами. Установлено, что розетки с бараньими эритроцитами образуют Т-лимфоциты. Для постановки данного теста из периферической крови выделяют лейкоцитарную массу путем отстаивания гепаринизированной или дефибринированной крови (спонтанное отстаивание или с добавлением желатина) и затем осаждают лейкоциты центрифугированием либо из цельной крови выделяют лимфоциты центрифугированием в градиенте фикол/гепак (уротраст, изопак, верографин). Затем лимфоциты соединяют с бараньими эритроцитами и через определенный срок инкубации готовят мазки, которые фиксируют глутаровым альдегидом и окрашивают азурэозином (либо просматривают в камере Горяева нативные препараты); в препаратах подсчитывают процент лимфоцитов, образовавших розетки с эритроцитами (не менее 3 эритроцитов, прикрепившихся к одному лимфоциту). Рекомендуется также пересчет количества розеткообразующих клеток в абсолютных показателях (так как число лимфоцитов в крови при различной патологии, естественно, имеет большие колебания). В норме в периферической крови обнаруживается 50—70% розеткообразующих Т-клеток.
В последние годы для определения и подсчета Т-лимфоцитов используют моноклональные антитела (ОКТ или других серий) против маркеров Т-лимфоцитов. Реакция состоит из этапов добавления моноклональных антител к взвеси лимфоцитов, антисыворотки против иммуноглобулинов, включающей, например, радиоактивную или флюоресцирующую метку с последую-щен ее регистрацией.
Реакция стимуляции Т-лимфоцитов митогенами. Установлено, что ряд митогенов, в первую очередь таких как фитогемагглютинин (ФГА) и конканавалин А (кон А), вызывают бласттрансформацию и митозы Т-лимфоцитов [Ling М., 1975]. Для постановки этого теста (с ФГА) лейкоциты или лимфоциты выделяют описанным выше способом и затем культивируют в присутствии митогена в течение 72 ч. По окончании культивирования готовят мазки, которые окрашивают азур-эозином или другим методом и подсчитывают (в процентах) число бласт-клеток (молодых клеточных форм) и (или) митозы. В норме в культурах с ФГА обнаруживается 60—95% бласт-клеток.
Другим способом оценки активации лимфоцитов под действием митогенов является подсчет включения Н3-тимидина (или других меченых предшественников нуклеиновых кислот или аминокислот) в ДНК. Для этого Н3-тимидин добавляют в культуру лимфоцитов за 2—12 ч до конца культивирования. После окончания инкубации клеточную массу отмывают, лизируют NaOH, гиамином или растворителем NCS (для выхода включенной радиоактивности в жидкость), помещают в сцинтилля-ционную жидкость и подсчитывают число импульсов в опыте (культура с ФГА) и в контроле (без ФГА) в жидкостном сцинтилляционном счетчике (например, отечественный счетчик СБС, БЕТА-2).
Определение субпопуляций Т-лимфоцитов производят различными способами. Существуют способы определения субпопуляций Т-лимфоцитов по степени связывания с бараньими эритроцитами: активное, авидное, стабильное, аффинное розеткообразование, гигантские розетки и т. д., по чувствительности к теофиллину и др. Наиболее признанным и распространенным методом определения регуляторных субпопуляций лимфоцитов является подсчет количества Т-хелперов/ индукторов и Т-супрессоров/цитотоксических лимфоцитов по наличию на их поверхности рецепторов для Fc-фрагментов иммуноглобулинов IgM и IgG соответственно (Тμ и Тγ-лимфоциты).
Для постановки данного теста используют эритроциты быка, покрытые кроличьими антителами (против них) классов IgM (для определения Т-хелперов) и IgG (для определения Т-супрессоров). Реакция состоит из нескольких этапов. Вначале выделяют лимфоциты на градиенте фикол/верографин, освобождаются от макрофагоподобных примесей инкубацией клеток на пластиковых чашках Петри. Неприлипшие лимфоциты смешивают с бараньими эритроцитами, обработанными нейроами-нидазой, после инкубации вновь отделяют на новом градиенте Т-лимфоциты, образовавшие розетки с эритроцитами (в осадке при центрифугировании), от В-лимфоцитов (в интерфазе) — этот этап можно повторить для лучшей очистки. Розетки разделяют хлоридом аммония или дистиллированной водой и освобожденные Т-лимфоциты используют в реакции розеткообра-зования с эритроцитами быка с IgG-антителами для определения Тглимфоцитов (супрессоров) и после 12-часовой инкубации в термостате в культуральной среде, содержащей 15—20% телячьей эмбриональной сыворотки и некоторых добавок, для восстановления IgM-рецепторов используют в реакции розетко-образования с эритроцитами быка, покрытыми IgM-антителами, для определения Тμ-лимфоцитов (хелперов).
Для функциональной оценки субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров можно разделить эти клетки (после постановки реакций розеткообразования) центрифугированием в том же градиенте фикол/верографин, как это описано выше при выделении чистой взвеси Т-лимфоцитов.
К настоящему времени получены моноклональные антитела (например, ОКТ4 и ОКТ8 или других серий) для определения Т-хелперов или Т-супрессоров, принципы которого описаны выше.
Определение супрессорной активности лимфоцитов (мононуклеаров). Супрессивная активность мононуклеаров может быть определена при активации кон А, используемого в относительно высокой концентрации или в так называемом спонтанном варианте. В первом случае испытывают действие на реакцию стимуляции тест-лимфоцитов в культуре с ФГА выделенных из крови больного лимфоцитов (описанным выше способом в градиенте фикол/верографин) и инкубированных в течение 24 ч в культуральной среде в присутствии кон А, а затем остановленных в пролиферативной реакции митомицином С. Во втором случае испытывают действие свежевыделенных лимфоцитов больного, обработанных митомицином С, предварительно не инкубированных.
Тест-лимфоцитами могут служить аутолимфоциты свеже-выделенные из крови исследуемого, либо лимфоциты’донора Их смешивают в равных количествах с лимфоцитами супрессивное действие которых испытывается, и определяют их активность в стимуляции бласттрансформации или синтеза ДНК в стандартной реакции с ФГА. Контролями служат: 1) реакция тест-лимфоцитов в чистой популяции в присутствии с ФГА. 2) то же без ФГА; 3) тест-лимфоциты с ФГА + лимфоциты больного, инкубированные в культуральной среде тот же период времени, но в отсутствие кон. А. Этот этап инкубации занимает соответственно 72 ч. О величине активированного или спонтанного супрессивного действия судят по степени снижения (подавления) реакции стимуляции тест-лимфоцитов в культуре с ФГА. Показателем супрессии служит индекс, вычисляемый разными способами.
Для оценки специфического клеточного противотуберкулезного иммунитета чаще используют реакцию стимуляции лимфоцитов туберкулином (PPD) и реакцию торможения миграции леикоцитов с тем же антигеном.
Реакция стимуляции лимфоцитов с PPD служит для определения степени сенсибилизации к микобактериальным антигенам реакция обусловлена взаимодействием Т-клеток с PPD). Методика постановки реакции при морфологическом учете бласттрансформации или при оценке степени синтеза ДНК не отличается от методики реакции с ФГА (срок культивирования 96 ч, доза PPD варьирует от 10 до 200 мкг). У здоровых людей с отрицательной пробой показатели реакции обычно не превышают 1% (при морфологическом учете).
Реакция торможения миграции с PPD служит для тех же целей, что реакция бласттрансформации. Для ее постановки лейкоциты получают, центрифугируя плазму, выделенную из крови одним из описанных выше методов (см. постановку реакции бласттрансформации с ФГА). Осадок лейкоцитов набирают в стеклянные капилляры диаметром 1 мм, центрифугируют в них и помещают в культуральные камеры, содержащие питательную среду (контроль) и PPD (опыт). Результат реакции оценивают через 24 ч по соотношению площадей, занимаемых мигрирующими клетками в опыте и в контроле. PPD применяют в концентрации 100—200 мкг/мл. У здоровых людей индексы реакции обычно варьируют от 0,8 до 1,2 (в зависимости от дозы антигена и наличия сенсибилизации клеток). Применяют также иные варианты метода, например миграцию лейкоцитов в агарозе.
Тесты оценки количества и реактивности В-клеток. Комплементарные розетки. Установлено, что в присутствии комплекса эритроциты — антисыворотка и комплемент розетки с эритроцитами (например, человека) образуют В-лимфоциты. Для постановки данного теста лимфоциты выделяют теми же способами, которые описаны выше. Затем тест-эритроциты человека [лучше группы 0(1)] инкубируют с антиэритроцитной сывороткой (получаемой от кроликов, иммунизированных эритроцитами человека). Следующим этапом служит инкубация эритроцитов, нагруженных антиэритроцит-ными антителами, с комплементом (источник комплемента — донорская человеческая сыворотка), после этого готовят систему эритроциты — антитела к ним и комплемент, соединяют с исследуемыми лимфоцитами, фиксируют их глутаровым альдегидом, делают мазки.
Последний этап — окраска и подсчет розеткообразующих лимфоцитов — тот же, что и при определении Т-розеток. В норме в периферической крови обнаруживают 10—20% комплементарных розеток.
Существуют и другие способы определения и подсчета В-лимфоцитов, основанные на выявлении поверхностных маркеров этих клеток, например, по наличию иммуноглобулиновых рецепторов с использованием системы эритроциты + антитела в методе розеткообразования. В-лимфоциты также могут образовывать розетки с эритроцитами мышей; в норме обнаруживается примерно 15—20% таких В-лимфоцитов. В последние годы появилась возможность определять количество В-клеток с помощью моноклональных антител, полученных против их маркеров, аналогично определению других популяций и субпопуляций иммунокомпетентных клеток.
Определение иммуноглобулинов сыворотки крови методом иммунодиффузии. Содержание иммуноглобулинов в периферической крови отражает функцию В-клеток, поскольку иммуноглобулины являются продуктами клеток этой популяции. Для постановки данного теста исследуемые сыворотки помещают в лунки в агаровом геле, содержащем антииммуноглобулиновые сыворотки (анти-IgG, -IgM, -IgA). Результат реакции оценивают, измеряя диаметр колец преципитации, после чего вычерчивают график зависимости квадратов радиусов колец преципитации от концентрации исследуемого иммуноглобулина в стандартной сыворотке. Вычислив квадрат радиуса кольца преципитации исследуемой сыворотки и антисыворотки и отложив это значение на графике, можно узнать количество иммуноглобулина в каждой исследуемой сыворотке. Необходимо помнить, что нормальное количество иммуноглобулинов различных классов у здоровых людей варьирует в зависимости от возраста.
Реакция стимуляции В-лимфоцитов липополисахаридом. Известно, что существует ряд митогенов, которые вызывают трансформацию В-клеток (например, липо-полисахарид Е. coli и др.). Для постановки этого теста лейкоциты и лимфоциты получают описанным выше способом, затем их инкубируют в течение 72—96 ч с ЛИС и готовят мазки, в которых подсчитывают число бласт-клеток. Можно также учитывать активность В-лимфоцитов по степени включения Н3-тими-дина, как это описано для постановки РБТ с ФГА.
Специфический гуморальный иммунитет можно оценить по количеству антител к антигенам микобактерий, выявляемых в сыворотке больных с помощью различных сывороточных тестов.
Реакция агрегатгемагглютинации. Данная реакция является высокочувствительным вариантом пассивной (непрямой) гемагглютинации. Для ее постановки эритроциты обрабатывают глутаровым альдегидом, затем нагружают туберкулином (ППД) (в модификации реакции гемагглютинации Миддлбрука — Дюбо туберкулином нагружают нативные, а в модификации Бойдена — обработанные танином эритроциты) ; затем эритроциты соединяют с сывороткой, в которой выявляют противотуберкулиновые антитела. Диагностическим титром, по данным разных авторов, считается уровень 1:8—1:16.
Реакция потребления комплемента (РПК) является модификацией реакции связывания комплемента; в отличие от последней в ней используют комплемент, имеющийся в собственной сыворотке, в связи с чем сыворотки не подвергают температурной инактивации. Это выгодно отличает данную реакцию от ее прототипа, поскольку температурная обработка нередко снижает титр антител.
РПК ставят в два этапа, первый из которых состоит из взаимодействия антител, имеющихся в сыворотке больного, антигена (например, туберкулина) и присоединения к комплексу антиген — антитело комплемента, содержащегося в исследуемой сыворотке. Второй этап включает в себя добавление гемолитической системы (бараньи эритроциты+антисыворотка против бараньих эритроцитов), с помощью которой регистрируют степень потребления комплемента при первом этапе реакции. Следовательно, чем выше титр специфических антител, тем больше связалось комплемента комплексом антиген — антитело, меньше его осталось в сывортке и тем в меньшей степени произошел гемолиз бараньих эритроцитов, а следовательно, слабее окраска надосадочной жидкости (интенсивность окраски регистрируется на ФЭК). Титр антител выражают в условных единицах (экстинкциях), соответствующих показаниям прибора (ФЭК); он равен разнице интенсивности окраски в контроле (где к сыворотке добавлен вместо антигена изотонический раствор натрия хлора и, следовательно, отмечается наиболее полный гемолиз) и в опыте. Диагностическим титром считается показатель 0,07.
Определение иммунных розеткообразую-щих лимфоцитов. Эта методика служит для количественного подсчета числа специфически сенсибилизированных к антигенам микобактерий В-лимфоцитов. Лимфоциты для постановки данного теста выделяют обычным способом. Эритроциты человека [лучше группы 0(1)] обрабатывают танином и PPD. Как и в описанных выше других модификациях теста розетко-образования, эритроциты соединяют с лимфоцитами и подсчитывают число розеток в окрашенных препаратах. У здоровых людей обнаруживается 1—3% таких розеток.
Туберкулинпровокационные тесты. Информативность различных иммунологических методов в значительной степени повышается, если постановку тестов специфического гуморального (например, РАГА) и (или) клеточного иммунитета (например, РБТ и РТМ) сочетать с подкожным введением туберкулина (провокацией). Иммунологические реакции ставят до и после (через 48 ч) подкожного введения туберкулина (в среднем 20 ТЕ детям и 50—100 ТЕ взрослым).
А. Е. Рабухин с соавт. (1980), С. М. Лобанова (1982) сообщили об успешном применении иммуноглобулино-туберкулино-вой пробы, заключающейся в определении количества иммуноглобулинов G, А, М до подкожной провокации туберкулином, через 48 ч после нее и повторно через 7 дней. Известно также использование определения иммунных розеткообразующих лимфоцитов в сочетании с подкожной провокацией туберкулином.
Применение иммунологических методов для решения клинических задач диагностики туберкулеза. Интерпретация результатов иммунологического обследования больных туберкулезом приносит наибольшую пользу, если она осуществляется в сопоставлении с клинической характеристикой; именно в этом случае подобное обследование приобретает особую ценность, позволяет производить дифференциальную диагностику, судить о степени активности заболевания, прогнозировать его течение, а при динамическом наблюдении — контролировать эффективность проводимого лечения. Это — наиболее важные клинические задачи, при решении которых определение состояния иммунитета, особенно специфического, может принести существенную пользу.
При активном туберкулезе показатели специфических имму-.логических тестов обычно бывают положительными.
Важно подчеркнуть, что показатели иммунологических тестов могут сильно варьировать в различные фазы течения активного туберкулеза. Одни из тестов более выражены при вспышке туберкулеза, другие — при рассасывании инфильтративных поражений. Их показатели зависят от степени активности, направленности динамики поражений в сторону прогресси-рования или инволюции, от темпов такой динамики. Так, результаты, полученные при использовании реакций бласттранс-формации и торможения миграции с PPD, показали, что первая наиболее выражена при благоприятном течении процесса с быстрым рассасыванием специфических поражений (показатели более 10% бласт-клеток), а вторая — при прогрессировании процесса (индексы ниже 0,4—0,5), и наоборот. Наиболее высокие титры противотуберкулезных антител (1:256—1:1024) встречаются при выраженной активности процесса и начавшейся положительной динамике. В эти же сроки можно отметить и самый высокий процент обнаружения иммунных розеткообразующих лимфоцитов (5—10%). Следовательно, показатели иммунологических тестов должны служить при этом как бы исходным материалом для решения клинических задач с учетом кли-нико-рентгенологических данных. Естественно, что наиболее достоверные суждения о состоянии и изменении специфической реактивности дают повторные иммунологические исследования. Показатели тестов оценки потенциальной активности Т-лимфоцитов чаще мало отличаются от таковых у здоровых людей, однако при обострении заболевания как уровень бластообразования к ФГА, так и число Т-розетко-образующих лимфоцитов оказывались сниженными (45—60 и 35—50% соответственно).
В активной фазе туберкулеза несколько повышенными были также уровень содержания В-розеткообразующих лимфоцитов (15—25%) и число некоторых классов иммуноглобулинов (чаще IgA и IgG). Наибольшие трудности возникают при установлении минимальной (скрытой) активности туберкулеза, которая имеет место, например, при первичном выявлении ограниченных изменений в легких либо на поздних этапах химиотерапии или у диспансерного контингента лиц при переводе в группы учета с неактивным туберкулезом либо снятии с учета, появлении симптомов интоксикации неясного генеза.
Выявление скрытой активности. Необходимо отметить, что при наличии минимальной активности туберкулеза показатели иммунитета в основном нормализуются и приближаются по своим значениям к таким, которые характерны для лиц с неактивными изменениями или для здоровых людей. В этот период течения туберкулеза обычно не отмечается нарушений общих механизмов клеточного и гуморального иммунитета по количественным и функциональным характеристикам, показатели специфических тестов могут быть незначительно более выраженными (РБТ и уровень противотуберкулезных, антител) по сравнению с неактивным туберкулезом или отрицательными (РТМ). Однако эти изменения становятся заметными в основном при выведении средних арифметических значений в группах больных с наличием минимальной активности и с реактивным туберкулезом. В каждом конкретном случае стандартное и однократное иммунологическое обследование, как правило, не помогает выявлению такой активности.
Между тем эта важная и вполне конкретная клиническая задача требует вполне определенного решения, поскольку почти во всех случаях подозрения на наличие минимальной активности обычно предпринимают пробное лечение химиопрепарата-ми в течение 1 1/2—6 мес и тщательное клинико-рентгенологическое обследование в динамике. Только после этого окончательно решают вопрос об активности процесса.
Однако так называемые туберкулино-провокационные иммунологические тесты дают возможность установить минимальную активность в более короткие сроки. Обычно для этих целей применяют специфические клеточные иммунологические реакции в сочетании с подкожным введением туберкулина. Изменение через 48 ч после введения туберкулина показателей РБТ с PPD в сторону снижения не менее чем на 20% от первоначального уровня и уменьшение индекса РТС с PPD не менее чем на 0,1 и ниже 0,8 свидетельствуют о такой активности.
В комплексе с указанными иммунологическими тестами в сочетании с подкожной туберкулиновой провокацией могут быть использованы сведения об изменении показателей и других специфических реакций, например, таких как РПГА или определение «иммунных» (к ППД) розеткообразующих лимфоцитов. Есть сообщения о применении иммуноглобулино-тубер-кулинопровокационного теста для диагностики активности туберкулеза легких, в котором учитывают изменения уровня иммуноглобулинов, особенно IgA и IgG, через 2 сут после провокации и через 1 нед. Постепенное нарастание их количества говорит об отсутствии активности заболевания, а резкое повышение (через 48 ч) с последующим снижением (через 7 дней) характерно для наличия активности процесса.
Оценка эффективности лечения. Пользуясь исходными параметрами, характерными для различных фаз течения туберкулеза и степени его активности, и особенно определяя различные показатели иммунитета в динамике, можно судить об эффективности применяемого лечения, поскольку в его процессе происходит закономерная смена этих фаз. При положительной динамике процесса показатели специфического бла-стообразования закономерно увеличиваются, уровень реакции торможения миграции снижается, а уровень противотуберкулезных антител в большинстве случаев повышается в ближайшие сроки от начала химиотерапии, а в последующем имеет тенденцию к снижению.
Определение иммунологического статуса больных туберкулезом перед лечением может способствовать оценке течения туберкулеза в процессе лечения. Обычно нарушения параметров иммунитета, особенно специфического, находятся в соответствии с протяженностью инфильтрации, распространенностью поражений, массивностью бактериовыделения. При этом чем менее выражены нарушения в системе клеточного иммунитета, чем выше показатели специфического бластообразования и индексы реакции торможения миграции лейкоцитов при невысоком специфическом антителообразовании, тем благоприятнее протекает заболевание, быстрее по срокам наступает прекращение бактериовыделения, рассасывание инфильтрации, закрытие полостей распада.
При успешной химиотерапии нарушения характеристик различных систем иммунокомпетентных клеток, как правило, быстро ликвидируются, а показатели специфических иммунологических тестов претерпевают описанные выше изменения соответствующие благоприятному течению туберкулеза. Наблюдение в динамике позволяет контролировать эффективность лечения быстрое и эффективное восстановление показателей иммунитета совпадает по срокам с быстро наступающей положительной динамикои (а иногда и предшествует ей). Сохранение нарушении иммунитета, как правило, наблюдается при торпидном затяжном характере течения туберкулеза и неэффективной химиотерапии. Так, если в процессе лечения не восстаналиваются до нормы количество и функциональная активность Т-лимфоцитов, то среди этой группы больных возможны обострения заболевания. Стойкое сохранение подобных дефектов после окончания основного курса лечения должно настораживать клинициста в отношении появления рецидивов.
Целый ряд опубликованных данных указывает на то, что иммунологическое обследование больных туберкулезом является необходимым при использовании различных патогенетических способов лечения. Имеются сведения о том, что исходный иммунологический фон может иметь значение при прогнозировании возможных осложнений после оперативных вмешательств по поводу туберкулеза. И, наконец, безусловно необходимо иммунологическое обследование .для определения показаний к назначению различных иммуно-модуляторов, например, левамизола, диуцифона, тималина, так-тивина и др. в комплексном лечении туберкулеза легких, а также в процессе этого лечения с целью контроля эффективности подобной терапии.
источник
Весь контент iLive проверяется медицинскими экспертами, чтобы обеспечить максимально возможную точность и соответствие фактам.
У нас есть строгие правила по выбору источников информации и мы ссылаемся только на авторитетные сайты, академические исследовательские институты и, по возможности, доказанные медицинские исследования. Обратите внимание, что цифры в скобках ([1], [2] и т. д.) являются интерактивными ссылками на такие исследования.
Если вы считаете, что какой-либо из наших материалов является неточным, устаревшим или иным образом сомнительным, выберите его и нажмите Ctrl + Enter.
Величины реакции торможения миграции лейкоцитов в крови в норме: миграция с фитогемагглютинином (ФГА) — 20-80%, с конканавалином А (КонА) — 40-75%, со специфическим антигеном — 80-120%.
Реакция торможения миграции лейкоцитов позволяет оценить способность Т-лимфоцитов к выработке лимфокинов в ответ на антигенную стимуляцию. Этот тест оценки функциональной активности Т-лимфоцитов может быть использован для диагностики иммунологической недостаточности (реакция с митогенами), гиперчувствительности (аллергии) замедленного типа (реакция со специфическим антигеном или аллергеном). Реакция торможения миграции лейкоцитов может быть также использована для выявления иммунного ответа на возбудителей инфекций, для определения степени гистосовместимости и при опухолевых процессах.
Этот тест характеризует активность воспалительного процесса. Увеличение реакции торможения миграции лейкоцитов следует рассматривать как прогностически благоприятный фактор; клинически это сопровождается более быстрым выздоровлением больных острыми хирургическими заболеваниями после оперативного вмешательства и укорочением послеоперационного периода. Торможение миграции лейкоцитов может быть очень значительным при аллергических реакциях. Заболевания и состояния, приводящие к изменению реакции торможения миграции лейкоцитов
- Функциональная недостаточность Т-лимфоцитов, иммунодефицит (в том числе ВИЧ-инфекция), врождённые дефекты Т-звена иммунитета
- Хронизация воспалительного процесса
- Новообразования
- Тяжёлые ожоги, травмы, стресс
- Кишечные и почечные синдромы потери белка, старение
- Недостаточность питания
- Лечение цитостатиками и иммунодепрессантами
- Ионизирующее излучение
- Снижение миграции со специфическим антигеном или аллергеном свидетельствует о сенсибилизации лимфоцитов к этим антигенам (аллергии)
- Снижение миграции с митогенами свидетельствует о гиперактивности иммунной системы при аллергических и аутоиммунных заболевания
Заболевания и состояния, приводящие к изменению количества В-лимфоцитов, несущих IgA
источник
тойчивость к рифампицину. Установлено, что 95% устойчивых к рифампицину штаммов МБТ содержат точечные мутации (делеции и вставки в гроВ гене, кодирующих (3-субъединицу РНК-полимеразы). Это является косвенным маркером множественной лекарственной ус тойчивости, т.к. 80-90% устойчивых к рифампицину штаммов МБТ являются также устойчивыми и к изониазиду. Результаты молекуляр- но-генетического изучения точечных мутаций в гроВ гене могут быть получены на 3-4 день исследования.
Наиболее трудная ситуация в диагностике туберкулеза возника ет у больных с клинической симптоматикой в случае отсутствия мок роты, а также тогда, когда в мокроте МБТ не обнаружены.
У таких больных при рентгенологическом исследовании тубер кулез может проявляться очаговыми, инфильтративными изменения ми в легких, диссеминацией, кавернами, увеличением внутригрудных лимфатических узлов и плевритом. Несмотря на описание рентгено логической картины, характерной для туберкулеза, диагноз этого за болевания не следует ставить только на основании данных клиникорентгенологического обследования. Перечисленные рентгенологиче ские изменения можно наблюдать не только при туберкулезе, они требуют дифференциальной диагностики.
В этих случаях диагностика туберкулеза легких во многом осно вывается на лучевых методах исследования органов грудной клетки. Эти методы дополняют результаты клинического обследования боль ных, при этом сочетанный анализ их дает возможность повысить чув ствительность и специфичность, а при отрицательных данных мик робиологического и морфологического исследования, при так назы ваемом «абациллярном» туберкулезе легких, имеют решающее зна чение. Рентгеновская компьютерная томография легких при этом яв ляется ведущим диагностическим методом.
Рентгено-томографическая картина туберкулеза легких отлича ется полиморфизмом, как по характеру инфильтративных изменений, так и по локализации специфических изменений и требует целена правленной дифференциальной диагностики.
Специфическое туберкулезное воспаление имеет разнообразные рентгенологические проявления — от одиночных или множественных сливных очагов, округлых инфильтратов и перециссуритов до доле-
вых туберкулезных пневмоний. Однако большинству присуща лока лизация процесса’в 1-2 и 6 сегментах легких.
Для всех вариантов туберкулеза легких характерно не только наличие очаговых и инфильтративных теней, но и довольно часто ка верны, которая, как правило, сопровождается бронхогенным обсеме нением, имеющим определенные закономерности, что может служить диагностическим признаком.
При наличии каверны в верхней доле левого легкого типично наличие очагов обсеменения по периферии и в передних (3, 4 и 5) и нижних (7, 8, 9, 10) сегментах. При правосторонних кавернах очаги обсеменения распространяются на нижележащие отделы той же доли с преимущественным поражением 3-го сегмента, а также возникает перекрестное метастазирование в левое легкое, преимущественно в 4-
й и 5-й сегменты и сегменты пирамиды нижней доли.
В клинической практике диагностическое значение пробы Ман ту с 2 ТЕ ППД-Л у взрослых пациентов с рентгенологически выяв ляемыми изменениями в легких определяется ее отрицательной или гиперергической реакцией. При наличии у больного отрицательной реакции Манту (уколочная реакция на месте введения) изменения в легких с большей долей вероятности относятся к нетуберкулезным процессам. При наличии гиперергической реакции (размер папулы 21 мм и 6|»лее в диаметре или везикуло-некротические реакции незави симо от размера папулы) изменения в легких с большей долей веро ятности относятся к туберкулезным.
Положительная реакция Манту 2 ТЕ ППД-Л с размером папулы от 5 до 20 мм в диаметре диагностического значения не имеет, т.к. более 70% взрослого населения к 30 годам уже инфицированы. Для диагностики туберкулеза, более важное значение, имеет вираж тубер кулиновой пробы (впервые положительная реакция Манту с 2 ТЕ ППД-Л или увеличение размера папулы на 6 мм и более за год) и гиперергическая реакция на пробу Манту. Особенно это характерно для туберкулеза легких у лиц молодого и старческого возраста. У таких пациентов специфические изменения в легких с большей долей веро ятности можно отнести к туберкулезным.
Постановка пробы Манту с 2ТЕ ППД-Л входит в обязательный диагностический минимум исследования больных с подозрением на туберкулёз. У взрослых больных с рентгенологически видимыми из-
менениями в органах дыхания или внелегочными поражениями диаг ностическое значение имеют отрицательная или гиперергическая ре акция на пробу Манту с 2 ТЕ ППД-Л. Так, при наличии отрицатель ной реакции на туберкулин изменения в легких и других органах с большей долей вероятности не связаны с туберкулёзной инфекцией. Гиперергический характер ответной реакции, особенно у пожилых, скорее всего, будет указывать на туберкулёзную природу заболева ния. Нормергичеокие реакции на пробу Манту большого диагности ческого значения не имеют, так как большинство взрослого населе ния (70-85%) к 30 годам инфицированы МБТ.
Подкожная проба Коха применяется в стационарных условиях для диагностики туберкулеза, особенно в случаях его внелегочной локализации, а также определения степени активности выявленных туберкулёзных изменений. Чаще всего используется доза 20 ТЕ ППД- Л. При отрицательном результате на пробу Коха с 20 ТЕ ППД-Л уве личивают дозу до 50 ТЕ, а потом до 100 ТЕ ППД-Л. При постановке пробы Коха учитывают местную (в области введения туберкулина), очаговую (в области очага специфического поражения) и общую ре акцию организма, а также изменения в крови (гемотуберкулиновая и протеинотуберкулиновая пробы). Предварительно показатели крови и плазмы определяют до введения туберкулина и через 48 часов после него. Общая реакция характеризуется повышением температуры тела на 0,5°С, симптомами интоксикации, очаговая — обострением тубер кулёзных изменений, местная — образованием инфильтрата в месте введения туберкулина диаметром 10-20 мм. Гемотуберкулиновая проба считается положительной, если отмечается повышение СОЭ на 6 мм в час и более, увеличение количества лейкоцитов на 1000 и бо лее, сдвиг лейкоцитарной формулы влево, уменьшение лимфоцитов на 10% и более. Протеинотуберкулиновая проба оценивается как по ложительная, если отмечается снижение альбуминов и увеличение а- и у — глобулинов на 10% от исходных данных. Пробу Коха сочетают также с иммунологическими тестами (бласттрансформации, мигра ции макрофагов и др.)
Проба Коха считается положительной при изменении любых трех показателей и более. Следует помнить, что очаговая реакция имеет наибольшее значение в оценке этой пробы.
Применяемые в настоящее время лабораторные и иммунологи ческие методы диагностики туберкулеза легких носят в основном косвенный характер и применяются комплексно для повышения зна чимости верификации диагноза.
Иммунологические методы, которые применяются для оценки состояния основных систем иммунитета, определение их клеточных структур, а также степень развития специфических иммунологиче ских реакций, могут помогать в решении ряда задач в клинике тубер кулеза:
• в определении активности туберкулезного процесса;
• в определении характера течения заболевания;
• в проведении дифференциальной диагностики. Уточнение иммунологического статуса больного важно:
• для выявления иммунологической недостаточности;
• для определения показаний к назначению иммуномодулирующей терапии;
• для диагностики лекарственной непереносимости, возникающей в процессе химиотерапии.
Для оценки иммунного статуса больных туберкулезом использу ется набор иммунологических методов:
1. Тесты для оценки количественного состояния Т- и В- лимфоцитов (СБЗ+ и СШ2+ клеток) и регулято|»ньгх субпопуляций Т-хелперов и Т-супрессоров (С04+ и С08+ клеток).
Используется реакция розеткообразования с бараньими эритро цитами или моноклональные антитела против поверхностных марке ров СБЗ -1-, С022+, СОА ь и С08+ лимфоцитов. В норме СЭЗ+ клетки составляют 60-70%, СЭ22+ клетки — 15-20%, СЕН+ клетки — 35-65% и СЛ)8+ клетки — 10-30%. Индекс соотношения СЮ4+ : СБ8+ = 1,8-2,2.
2. Тесты для оценки функциональной активности сенсибилизи рованных к соответствующим антигенам Т -лимфоцитов т УНГО.
Реакция стимуляции Т-лимфоцитов митогеном фитогемаглютинином (РБТЛ с ФГА), который вызывает неспецифическую бласттрансформацию и митозы Т-лимфоцитов, свидетельствует о выра женности их функциональной активности. Лимфоциты культивируют с ФГА в течение 72 часов и определяют вклижиие ЗН-тимидина в ДНК по числу импульсов в сцинтилляционивщ счетчике. В норме бласттрансформации подвергаются 50-60% лимфоцитов.
Реакция стимуляции Т-лимфоцитов с туберкулином (РБТЛ с РРБ), который вызывает специфическую стимуляцию и определяет степень сенсибилизации к микобактериальным антигенам. В норме бласттрансформации подвергаются 2-6% лимфоцитов.
3. Тесты на определение функциональной, миграционной и адге зивной активности фагоцитов (лейкоцитов и макрофагов).
Реакция торможения миграции лейкоцитов с туберкулином ш V/- 1го (РТМЛ с РРБ) в капиллярах. В норме индекс активности состав ляет 0,8-1,2.
Реакция торможения миграции макрофагов (РТММ) т У/УО ме тодом «кожного окна», разработанного В.Ю.Мишиным. При этом ме тоде на предплечье наносятся две скарификации эпидермиса на пло щади 0,5×0,5 см и в одну из них внутрикожно вводится 0,1 мл 2 ТЕ ППД-Л. На оба участка скарификации накладывают предметные стекла (2×2 см) фиксированные лейкопластырем. Через 24 часа стекла снимают и фиксируют метиловым спиртом, окрашивают по Рома- новскому-Гимзе и просматриваются под световым микроскопом, где в 1000 клетках подсчитывают процентное соотношение макрофагов. При этом диагностическим критерием является торможение мигра ции макрофагов после внутрикожного введения 2 ТЕ ППЛ-Л на 20% и более.
Показателями иммунодефицита по приведенным выше иммуно логическим тестам Являются: количество СЮЗ+ клеток 30%, при их соот ношении СЮ4+:СГ)8+ ех >ишпйЪт. При этом назна чают химиотерапию четырьмя противотуберкулезными препаратами (изониазид, рифампицин, пиразинамид и этамбутол). В таких случаях через 2 месяца необходимо повторное рентгенологическое исследо вание. При заболевании туберкулезной этиологии отмечается частич ное или полное рассасывание воспалительных изменений. Это так на зываемый отсроченный диагноз. К этому времени удается получить результаты посева мокроты на питательные среды, сделанного перед началом химиотерапии. Рост культуры при наличии в материале ми кобактерий туберкулеза обычно отмечается через 4-8 недель, что служит подтверждением диагноза.
В настоящее время туберкулез органов дыхания часто сочетается с различными заболеваниями внутренних органов. Клинические прояв ления заболеваний нетуберкулезной этиологии вынуждают больного обращаться за медицинской помощью, а туберкулезный процесс про текает малосимптомно и незаметно для больного. В таких случаях больные обращаются в поликлиники, их госпитализируют в стацио нары различного профиля. При подозрении на малосимптомное тече ние туберкулеза нужно по возможности собрать 3 порции мокроты в течение 2-3 дней и провести микроскопическое исследование 3 маз ков, назначить рентгенологическое исследование.
ДМ И 2 — включают бронхоскопию с различными видами био псий (аспирационная, щеточная и др.) и бронхоальвеолярным лаважем; пункцию плевральной полости и плевробиопсию; транстора кальную биопсию легкого; торакоскопию, медиастиноскопию и, на конец, открытую биопсию легкого с последующими цитологически ми, гистологическими и микробиологическими исследованиями по-
лученного материала. Обнаружение в биоптате специфических эле ментов туберкулезной гранулемы (казеоз, эпителиоидные и много ядерные клетки) позволяет морфологически верифицировать тубер кулез легких и своевременно начать противотуберкулезное лечение.
ФМИ — весьма многочисленны и направлены не столько на ди агностику туберкулеза, сколько на определение функционального со стояния различных внутренних органов и обменных процессов. Это исследования уровня глюкозы в крови, функции печени, сердечно сосудистой системы, функции внешнего дыхания, газового состава крови, легочного кровотока и т.д.
Диагноз туберкулеза нужно формулировать в соответствии с официальной клинической классификацией. Сначала указывают кли ническую форму туберкулеза, локализацию процесса в легких по до лям и сегментам, фазу и результаты исследования мокроты: МБТ+ или МБТпо данным микроскопического исследования, уточненного результатами посева материала на питательные среды, лекарствен ную устойчивость к конкретным противотуберкулезным препаратам, осложнения, сопутствующие заболевания.
Правильная и своевременная диагностика туберкулеза органов дыхания позволяет выявить больных на ранних этапах развития забо левания, а химиотерапия, начатая вовремя, позволит предотвратить развитие у них распространенных, прогрессирующих форм с выделе нием МБТ.
ОДМ следует выполнять, как это следует из самого названия, в полном объеме. ДМИ и ФМИ применяют по показаниям.
Для диагностики и дифференциальной диагностики туберкулеза и других заболеваний легких в клинической практике широко ис пользуются цитологические методы исследования, которые состоят из двух этапов: клинического и микроскопического. Клинический этап дает представление о том, каким методом и как правильно со брать материал, чтобы получить оптимальный результат в самые ко роткие сроки.
Существует два основных способа получения материала из лег ких для цитологического исследования:
• эксфолиативный материал — мокрота. Мокрота бывает спонтанной
и редуцированной, полученной с помощью различных раздражите лей (отхаркивающих средств, раздражающих ингаляций и т. д.).
• биопсийный материал, полученный при трансторакальной игловой биопсии и с помощью бронхологических методов исследования (чрезбронхиальная щипцовая биопсия легких, игловая биопсия легких и внутригрудных лимфатических узлов, браш-биопсия и соскоб слизистой бронха, эндокавитарная биопсия, аспираты, бронхиолоальвеолярный лаваж — БАЛ).
Цитологическое исследование мокроты. В клинике туберкулеза в последнее время используют методику цитологического исследова ния мокроты, основанную на изучении макро-, микроскопического и цитологического анализа.
При исследовании мазков, окрашенных по гематологической методике, ряд признаков, свойственных той или другой ткани, вы является значительно ярче, чем при исследовании нативных препа ратов. Это имеет существенное значение для цитологического за ключения.
Наиболее информативной для цитологического исследования считается мокрота, собранная утром, натощак и которая хранится не более 2-4 часов до начала исследования. Количество проб, необходи мых для исследования при туберкулезе — 2-3, при подозрении на опу холь — 5-6.
У больных активным туберкулезом легких мокрота имеет, чаще всего, имеет слизисто-гнойный или гнойный характер. При микро скопическом исследовании препаратов слизисто-Люйной мокроты, окрашенных по гематологической методике, выявляются скопления мононуклеарных клеток, которые представлены в основном альвео лярными макрофагами, лимфоцитами и эпителиоидными клетками с примесью небольшого количества нейтрофилов в стадии деструкции. При микроскопическом исследовании гнойной мокроты больных ту беркулезом число нейтрофилов возрастает и становится преобла дающим, иногда они располагаются на фоне казеозного некроза. У 14-32% больных активным туберкулезом легких можно обнаружить элементы эпителиоидно-клеточной гранулемы: эпителиоидные клет ки и гигантские клетки Пирогова-Лангханса (Е.Д.Тимашева). Кроме этого, в мокроте больных туберкулезом часто встречаются скопления эозинофилов, появление которых чаще связано с приемом химиопрепаратов, но может быть также проявлением местных аллергических реакций на туберкулезную инфекцию.
Цитологическая картина мокрота больных туберкулезом имеет некоторые особенности. Она отличается своеобразным розоватофиолетовым фоном, обусловленным наличием казеозного детрита, располагающегося в виде аморфных масс, и нейтрофилами преиму щественно и стадии полного расплавления.
Определенное диагностическое значение имеет обнаружение так называемой тетрады Эрлиха, составными элементами которой явля ются обызвествленные эластические волокна, кристаллы холестери на, соли аморфных фосфатов, микобактерий туберкулеза, чаще в виде мелких осколков; иногда находят неполную тетраду. Ее наличие ука зывает на обострение старых, обычно обызвествленных очагов в легких.
Указанная выше цитологическая картина мокроты характернапреимущественно для выраженных активных форм туберкулеза. При неактивном и менее выраженном туберкулезном процессе в легком мокрота не имеет специфических цитологических черт. В этих случаях обнаруживаются только клетки плоского эпителия, альвеолярные макрофаги и нейтрофилы, что не является специфич ным для туберкулеза, такая картина может наблюдаться при раз личных процессах в легких и верхних дыхательных путях.
Цитологическое исследование мокроты наиболее показано при дифференциальной* диагностике туберкулеза и опухолей легких (мокрота, собранная через 24 часа после проведения бронхоскопии, может дать положительный результат даже при отрицательном ре зультате бронхоскопии), грибковых поражениях, гемосидерозе, адематозе, медиастинально-легочной формы лимфогранулематоза.
Цитологическое исследование материала биопсий. Наиболь шее распространение в последние десятилетия получили бронхологические методы взятия биопсийного материала для цитологического исследования, что связано с их малой травматичностью по сравнению с другими методами (трансторакальной игловой и открытой биопси ей легких) и возможностью проведения комплекса биопсий у одного больного, что позволяет повысить результативность исследования.
Метод трансторакальной игловой биопсии легкого показан при отрицательных результатах цитологического исследования мокроты и материала, полученного при бронхоскопии. Наилучшие результаты цитологического исследования при использовании вышеуказанного
метода получают при наличии крупноочаговых изменений в легких, расположенных субплеврально.
Эффективность этих методов различна при разных заболевани ях, зависит также от квалификации бронхолога, хирурга и цитолога, правильного выбора вида биопсии.
При взятии материала с помощью трансторакальной игловой биопсии легкого и комплекса биопсий при бронхоскопии препараты готовит врач, выполняющий исследование или хорошо обученная медицинская сестра. После высушивания их на воздухе препараты доставляются в лабораторию, где подвергаются окраске гематологи ческими красителями.
При микроскопическом исследовании туберкулезное воспаление проявляется в основном двумя морфологическими критериями: фор мированием эпителиоидно-клеточных гранулем и образованием, ча ще в их центре, казеозного некроза, представляющего собой аморф ные бесструктурные массы фиолетового цвета, которые часто содер жат вкрапления солей извести. Наличие казеозного некроза является основным цитологическим признаком, позволяющим проводить дифференциальную диагностику туберкулеза и саркоидоза, как наи более часто встречающихся гранулематозных заболеваний. При ту беркулезе чаще встречаются гигантские клетки Пирогова-Лангханса, при сарцсоидозе — клетки инородных тел. При длительно текущем ту беркулезном воспалении наблюдается наличие фиброзных измене ний, кальцинация участков казеозного некроза. При разжижении казеозных масс отмечается выраженная нейтрофильная инфильтрация, дистрофические изменения эпителиальных клеток.
Сложность дифференциальной диагностики туберкулеза и дру гих гранулематозных заболеваний легких, с морфологической точки зрения, заключается в том, что легкое на любое длительно проте кающее воспаление как специфической, так и неспецифической при роды, на любой персистирующий в тканях агент органической и не органической природы реагирует относительно мономорфной карти ной, сопровождающейся, в большинстве случаев образованием гра нулем, которые при разных заболеваниях имеют свои морфологиче ские особенности, которые не всегда, к сожалению, позволяют диф ференцировать эти заболевания.
источник