Тест система пцр при туберкулезе

Наборы реагентов «Амплитуб» для быстрой диагностики туберкулёза, в том числе с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ, ШЛУ-ТБ).

В 2004 году по инициативе д.м.н., профессора Михаила Александровича Владимирского, заведующего сектором молекулярной диагностики туберкулёза НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова, мы начали разработки в области ПЦР-диагностики туберкулёза.
«Амплитуб» — технология быстрой молекулярно-генетической диагностики туберкулёза для выявления микобактерий туберкулёзного комплекса, определения инфекционной опасности больного, определения антибиотикоустойчивости к препаратам I и II ряда, идентификации и генотипирования микобактерий.

Технология «Амплитуб» состоит из 3-х основных этапов: пробоподготовки, выделения ДНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Оригинальные технологические разработки нашей компании применяются на каждом из этих этапов и в совокупности обеспечивают высочайшую чувствительность, специфичность и информативность анализа, быстроту получения результатов и их высокую достоверность.

Пробоподготовка: в процессе инкубации с «Амплитуб-Преп» происходит инактивация микобактерий, разжижение и гомогенизация респираторных образцов.

Выделение ДНК: использование оригинальных реагентов и магнитных частиц обеспечивает получение максимального количества чистой ДНК и позволяет автоматизировать процесс выделения ДНК.

ПЦР в реальном времени: одновременная детекция нескольких различных участков генома комплекса микобактерий туберкулёза (МБТ) увеличивает информативность и достоверность анализа.

Преимущества технологии «АМПЛИТУБ»

Скорость
Технология «Амплитуб» позволяет сократить время, необходимое для обнаружения M.tuberculosis complex и определения лекарственной устойчивости с 1-3 месяцев до 1 дня в сравнении с традиционными культуральными методами.

Высокая достоверность результатов
Высокая достоверность результатов обеспечивается как на этапе обнаружения МБТ, так и на этапе определения антибиотикоустойчивости. Применение технологии «Амплитуб» позволяет обнаружить МБТ с высокой чувствительностью (не более 100 КОЕ/мл мокроты) и 100% специфичностью. Точное определение мутаций в наиболее значимых кодонах основных генов, ассоциирующихся с лекарственной устойчивостью к рифампицину и изониазиду, позволяет определить 90% антибиотикоустойчивых образцов со специфичностью, близкой к 100%

Безопасность
Клинические образцы инактивируются с помощью «Амплитуб-Преп» уже на этапе взятия и транспортировки биологического материала.

Возможность работы с клиническими образцами
Важным преимуществом технологии «Амплитуб» является возможность исследования не только культур микобактерий, но и непосредственно клинического материала (мокроты, промывных вод бронхов, спинномозговой жидкости, экссудата, пунктата, биоптата, мочи, отделяемого половых путей).

Автоматизация
Роботизированная станция TECAN и набор реагентов «М-Сорб-Туб-Автомат» позволяют полностью автоматизировать наиболее трудоёмкий этап выделения ДНК. Технология «Амплитуб» обеспечивает автоматический расчет результатов ПЦР-анализа с указанием количества выявленного возбудителя в образце и конкретных мутаций, определяющих устойчивость к антибиотикам.

I этап – Пробоподготовка, инактивация

«Амплитуб-Преп» (инактивирующий реагент) специально адаптирован для обработки мокроты. Обладает исключительными муколизирующими свойствами, благодаря которым может использоваться вместо раствора NALC-NaOH для обработки мокроты перед молекулярно-генетическими исследованиями.

Клинические и технические испытания «Амплитуб-Преп» (инактивирующего реагента) проводились в ЦНИИ туберкулёза (Москва). 118 образцов мокроты от тяжёлых бациллярных больных с острым течением туберкулёза делили на две части, обрабатывали одну часть «Амплитуб-Преп», другую — NALC-NaOH.
Все образцы тестировали на BACTEC MGIT 960 и методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Рост микобактерий наблюдался только в контрольной группе, обработанной NALC-NaOH. В образцах, обработанных «Амплитуб-Преп», рост микобактерий не обнаружен. Результаты ПЦР-анализа образцов из обеих групп были положительными.

Компанией «Синтол» разработан ряд наборов реагентов для выделения ДНК микобактерий.

«М-Сорб-Туб» («Амплитуб-РВ» комплект №1)

набор реагентов для выделения ДНК (на магнитных частицах)

Адаптирован для выделения ДНК микобактерий из мокроты, промывных вод бронхов, спинномозговой жидкости, экссудата, пунктата, биоптата, мочи, отделяемого половых путей, культур клеток.
Набор «М-Сорб-Туб» обеспечивает лизис клеток, сорбцию ДНК на магнитных частицах, осаждение ДНК центрифугированием, промывку и элюцию ДНК.
Предлагаемая компанией «Синтол» методика выделения ДНК сочетает в себе достоинства сорбционного метода и метода осаждения спиртом.
Использование в качестве сорбента покрытых оксидом кремния магнитных частиц более удобно в сравнении с использованием других сорбентов, позволяет максимально стандартизировать и автоматизировать методику выделения ДНК.
В каждый исследуемый образец добавляется внутренний положительный контроль (ВПК), по реакции амплификации ВПК судят о наличии/отсутствии ингибиторов ПЦР и эффективности выделения ДНК.

«М-Сорб-Туб-Автомат» («Амплитуб-РВ» комплект №1а; №1в)

набор реагентов для выделения ДНК микобактерий из клинических образцов и культур клеток на автоматизированных станциях TECAN

Набор представляет собой модификацию набора реагентов «М-Сорб-Туб», разработанную специально для использования на автоматизированных станциях фирмы TECAN, что обеспечивает ряд следующих преимуществ.

Снижение риска контаминации во время выделения ДНК практически до нуля.
Значительное уменьшение трудоёмкости процесса выделения ДНК.
Стандартизированное выделение ДНК из клинических образцов.
Экономическая выгода: низкий расход пластика и реактивов.

набор реагентов для ускоренной пробоподготовки и выделения ДНК микобактерий из образцов мокроты

Совмещение процесса пробоподготовки и выделения ДНК из образцов мокроты позволяет провести эти два этапа работы за 1 час.
Минимальное количество манипуляций при пробоподготовке и выделении ДНК. Набор состоит из 3 рабочих растворов: «Амплитуб-Преп», лизирующего и элюирующего растворов.
Использование «Амплитуб-Преп» в составе набора «Экстра-Туб» позволяет увеличить выход ДНК в 5‑10 раз.

III этап – ПЦР в реальном времени

Обнаружение и количественное определение комплекса МБТ

Набор реагентов АМПЛИТУБ-РВ — это:

высокая достоверность анализа благодаря одновременному обнаружению двух специфичных генов M.tuberculosis complex: IS6110 и regX3;
оценка пригодности образца ДНК для определения антибиотикоустойчивости;
высокая чувствительность (не более 100 КОЕ/мл мокроты или 1–10 копий фрагментов ДНК в реакции) и 100%‑ая специфичность, подтверждённые на панели QCMD (Quality Control for Molecular Diagnostics) Mtb EQA (UK).

Определение антибиотикоустойчивости МБТ к препаратам I и II ряда

Наборы реагентов АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ, АМПЛИТУБ-FQ-РВ — это:

диагностика форм туберкулеза с лекарственной устойчивостью, в том числе множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ);
быстрая детекция мутаций M.tuberculosis, ассоциирующихся с устойчивостью к антибиотикам первого и второго ряда (рифампицину, изониазиду, этамбутолу, фторхинолонам);
достоверность результатов, ежегодно подтверждаемая при проведении Федеральной службой внешней оценки качества (ФСВОК) Росздравнадзора испытаний шифрованных тест-культур и образцов.

Наборы АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ и АМПЛИТУБ-FQ-РВ основаны на использовании оригинальной мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени, позволяющей выявлять мутации в генах микобактерий туберкулеза, ответственных за устойчивость к конкретным антибиотикам.

Ниже представлен перечень производимых нами наборов серии «Амплитуб»

Амплитуб-Преп — реагент для предобработки образцов, предположительно содержащих ДНК микобактерий (кат.№R-001) Регистрационное удостоверение № РЗН 2017/6634
АМПЛИТУБ-РВ — набор реагентов для для выделения, обнаружения и количественного определения ДНК микобактерий туберкулезного комплекса (кат. № ОМ-200а и ОМ-200ат (для автоматизированной станции TECAN)) Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/07635.
Амплитуб МБТК + НТМБ — набор реагентов для обнаружения ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса (МБТК) и нетуберкулёзных микобактерий (НТМБ)
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ — набор реагентов для определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулёзного комплекса к рифампицину и изониазиду методом ПЦР в реальном времени (кат. № ОМ-400) Регистрационное удостоверение № ФСР 2010/07636.
АМПЛИТУБ-FQ-РВ — набор реагентов для выявления генетических маркеров ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса, ассоциированных с устойчивостью к фторхинолонам, методом ПЦР в реальном времени (кат. № ОМ-800) Регистрационное удостоверение № РЗН 2017/5772
АМПЛИТУБ-ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ — набор реагентов для дифференциации видов микобактерий, входящих в M.tuberculosis complex (M.tuberculosis, M.bovis, M.bovis BCG и др. виды) (кат. № ОМ-114)
АМПЛИТУБ-Beijing — набор реагентов для определения генотипа Beijing микобактерий туберкулёза (кат.№ ОМ-115)
«Экспресс-Туб» — набор реагентов для быстрого выделения ДНК микобактерий из культур клеток (кат. № ОМ-518)

В 2006 году в НИИ Фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.Сеченова совместно с ЗАО «Синтол» был проведен скрининг более 2000 клинических образцов культур МБТ из 25 регионов Российской Федерации. Процент МЛУ-MБТ штаммов (к рифампицину и изониазиду), полученных от впервые выявленных пациентов, составил 21,9%, а процент MЛУ-MБТ штаммов, полученных от ранее леченных больных, был 58,5%. Совпадение результатов с данными микробиологическогоанализасоставило 94%. В рамках мониторинга был проведен молекулярно-генетический анализ диапазона и частоты встречаемости различных кодонов и мутаций в генах МБТ, ответственных за устойчивость к рифампицину и изониазиду.
В 2007 году проведены клинические испытания наборов по определению устойчивости к рифампицину и изониазиду.
В 2008–2011 годах проведена апробация наборов по определению устойчивости к препаратам резервного ряда (фторхинолонам, капреомицину, амикацину). В 2010 году разработан и испытан «Инактивирующий реагент А».
В настоящее время он продаётся под торговой маркой «Амплитуб-Преп».
В 2014–2017гг. в сотрудничестве с ФГБНУ «ЦНИИТ» разработан набор «Амплитуб-МБТК+НТМБ», позволяющий в 1 пробирке обнаружить ДНК микобактерий туберкулёзного комплекса и ДНК нетуберкулёзных микобактерий (без определения конкретного вида НТМБ).
В настоящее время ведётся разработка набора, позволяющего определять наиболее актуальные для российской популяции виды НТМБ.

Принцип мультиконкурентной аллель-специфичной методики ПЦР в реальном времени

В формате одной пробирки используются 5’-флуоресцентно-меченые аллель-специфичные праймеры с общим комплементарным им 3’-меченым олигонуклеотидом-гасителем и контрольный флуоресцентный зонд, комплементарный участку ДНК без мутаций.
При отсутствии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается только по флуорофору зонда.
При наличии мутаций в ДНК нарастание флуоресценции в ходе ПЦР-РВ наблюдается как по флуорофору зонда, так и по флуорофору 5’-флуоресцентно-меченого аллель-специфичного праймера. Данный метод позволяет определить не только точку мутации, но и процент устойчивого мутантного штамма МБТ на фоне дикого.

Интерпретация результатов выявления мутаций на примере
531 кодона rpoB гена M.tuberculosis

Гены, кодоны, замены, используемые в наборах реагентов
АМПЛИТУБ-МЛУ-РВ при определении антибиотикоустойчивости

Использование автоматизированных станций Freedom EVO (TECAN, Швейцария) для молекулярно-генетической диагностики туберкулёза

В 2011 году по инициативе сотрудников лаборатории молекулярно-генетических методов исследования ЦНИИТ РАМН группа разработчиков из ЦНИИТ под руководством профессора Черноусовой Ларисы Николаевны и «Синтола» впервые в России внедрила в лабораторную практику высокопроизводительную автоматизи-рованную систему выделения ДНК микобактерий на платформе Freedom EVO (TECAN) с использованием наборов реагентов «Амплитуб». Это позволило значительно сократить трудоёмкость ПЦР-диагностики туберкулёза и увеличить поток анализов.

Время анализа МБТ при использовании автоматизированных станций Freedom EVO («TECAN», Швейцария) и наборов реагентов «Амплитуб» («СИНТОЛ», Россия)

Трудозатраты — 1 час
Продолжительность выделения ДНК — не более 2 часов
Подготовка к амплификации и ПЦР-РВ — 1,5 часа

ИТОГО: результаты анализа будут готовы через 3,5 часа
Оператор затратит 1 час своего рабочего времени.

Устройство автоматизированной станции Freedom EVO («TECAN», Швейцария) показано ниже:

Выбирая технологию «Амплитуб» («Синтол») на платформе
Freedom EVO («TECAN»), Вы получаете:

Обнаружение возбудителя туберкулёза — 48 образцов за 3 часа.
Определение лекарственной устойчивости к препаратам I и II ряда за 1 день.
Уменьшение трудозатрат в 6 раз.
Увеличение производительности лаборатории.
Безопасность работы благодаря «Амплитуб-Преп».
Стандартизованное выделение ДНК.
Снижение риска контаминации лаборатории.
Низкую себестоимость 1 анализа.
Признательность фтизиатров за быструю и точную диагностику!

источник

Полимеразная цепная реакция (далее ПЦР) — это высокоточный метод молекулярно-генетического исследования материла, который позволяет выявить у человека различные инфекционные заболевания и установить генотип возбудителя.

ПЦР для выявления различных заболеваний стала применяться в самом конце прошлого века. Первооткрывателем этого метода исследования является американский биохимик Кэри Муллис. Свое открытие он сделал в 1983 году. Но еще несколько лет понадобилось, чтобы доработать метод.

С помощью ПЦР-диагностики можно обнаружить фрагменты чужеродного ДНК в любой жидкой среде организма. На анализ могут быть взяты такие жидкости:

Кровь.
Слюна.
Мокрота.
Выделения из половых органов.
Смывная жидкость бронхов.
Желудочный сок.

Лечащий врач сам определяет, какую биологическую жидкость лучше взять на анализ при конкретном заболевании.

ПЦР-диагностика позволяет не только обнаружить микрофрагменты чужеродной ДНК, но и определить к какому конкретному виду она относится. То есть с помощью ПЦР можно не только точно установить возбудителя заболевания, но и выяснить к какому виду он принадлежит.

Процесс анализа ПЦР — очень сложный. Он состоит из нескольких этапов:

Сначала нужно обнаружить фрагменты вредоносной ДНК в предоставленном образце.
Копирование фрагмента ДНК. Маленького участка ДНК для анализа недостаточно, поэтому его копируют. Нуклеиновая кислота может копироваться в пробирке с помощью фермента полимеразы (вне живого организма). В пробирке образуется множество клонов, то есть происходит цепная реакция. Весь процесс происходит в три этапа под воздействием различных температур.
Когда генетического материала становится достаточно для исследования, тогда возбудитель определяется обычными методами.

Метод ПЦР очень точен и может выявить наличие любого возбудителя по небольшому фрагменту ДНК или РНК.

ПЦР-анализ на туберкулез является самым информативным методом диагностирования этого заболевания. Относительно туберкулеза этот метод позволяет не только установить наличие микобактерий в организме, но и определить к какому виду они принадлежат.

Результат ПЦР диагностики может быть простой и расширенный. В простом результате указывается только наличие/отсутствие микобактерии. Расширенный результат дает представление о дополнительных параметрах протекания заболевания. Правильно понять, что написано в результате анализа ПЦР может только фтизиатр.

ПЦР-диагностика туберкулеза не проводится всем без исключения. Это объясняется дороговизной реактивов и недоступностью проведения исследования в некоторых отдалённых районах (в таких местах пользуются другими методами диагностики).

Показаниями для проведения ПЦР-исследования являются:

Длительный контакт с больным туберкулезом.
Беременность. ПЦР крови на туберкулез является самым быстрым и безопасным методом для беременной женщины.
Экстренная ситуация. Например, необходимость срочного оперативного вмешательства, при котором нужно точно установить наличие/отсутствие туберкулеза в организме.
Аллергическая реакция на туберкулиновые пробы.
ВИЧ-инфекция.
Невозможность диагностирования заболевания другими способами, при наличии явных признаков туберкулеза.
Неоднозначные симптомы, которые не позволяют создать четкую клиническую картину заболевания (болезни верхних дыхательных путей, сопровождающиеся большим количеством мокроты, кровохарканьем и пр.).

Метод ПЦР, при всей своей сложности и дороговизне, проводится и расшифровывается в течение нескольких часов. Что делает этот метод золотым стандартом при диагностике туберкулезной инфекции.

Забор материала — это первый этап при выполнении ПЦР-исследования. Для того, чтобы выполнить качественный анализ, нужно соблюдать определенные правила по сбору материла:

Для ПЦР мокроты на туберкулез нужно тщательно провести туалет полости рта. Делать это нужно вечером и утром перед анализом. Все это время не есть. Вечером выпить муколитическое средство для лучшего отхождения мокроты.
Перед сдачей крови на ПЦР нужно не употреблять пищу в течение 8 часов. Лучше всего производить забор крови утором натощак. Курить перед забором крови также нельзя. Кровь берется из вены на локтевом сгибе руки в стерильную пробирку. В эту же емкость добавляется антикоагулянт, чтобы кровь оставалась жидкой. Смешивать антикоагулянт с кровью нужно очень аккуратно, не делая резких движений. Если кровь была взята не в лабораторных условиях, то она должна быть предоставлена лаборанту до истечения пятичасового срока. Иначе результат может быть не точным.
Моча собирается в стерильную емкость утром, до приема пищи. Перед сбором мочи необходим тщательный туалет промежности.
Остальные виды жидкостей (смывы с бронхов, спинномозговая жидкость) может собрать только специалист в условиях стационара.
Перед забором жидкостей на ПЦР-исследование запрещено принимать некоторые препараты (например, прием некоторых антибиотиков нужно прекратить за две недели до забора материала).
Требования к лаборатории, в которой проводится забор анализов на ПЦР очень строгие. Лаборатория должна быть стерильна, чтобы не произошло перекрестное загрязнение материала. В этом случае результаты могут быть ложноположительными.

ПЦР-тест на туберкулез — высокоточный информативный анализ. И требования к его проведению крайне строгие. Чтобы анализ получился, нужно соблюдать регламент.

Для работы в ПЦР-лаборатории приглашаются специально обученные врачи: бактериологи, вирусологи, микробиологи. Все они прошли дополнительное обучение для работы на сложном оборудовании.

Лаборатория должна иметь лицензию на выполнение работ связанных с бактериологически-опасными вирусами и бактериями.

В самой лаборатории должны быть выделены такие рабочие зоны:

Зона приемки и сортировки проб.
Зона подготовки проб. В этом помещении выделяются нуклеиновые кислоты из образцов материала.
Зона проведения реакционных проб.
Зона для учета результатов и расшифровки анализов.

Все помещения располагают последовательно. Допуск в эти зоны разрешен только работающим там сотрудникам, которые при входе соблюдают правила личной защиты от бактерий и вирусов.

Лучше, если есть возможность расположить лабораторию в отдельно стоящем здании с собственной системой вентиляции.

В лаборатории соблюдаются стерильные условия работы, чтобы избежать перекрестного загрязнения проб. Даже если один фрагмент чужеродной ДНК попадет в исследуемый материал, ПЦР его размножит, и анализ получится ложноположительным.

В каждой зоне лаборатории имеется свой набор оборудования и посуды для проведения исследований. Также имеются свои холодильники, которые не могут быть использованы в других целях, кроме хранения материала конкретной зоны исследований.

Использованные расходные материалы и остатки биологического материала уничтожаются специальными способами, в соответствии с инструкциями.

ПЦР-тест на туберкулез имеет множество плюсов, которые делают этот метод диагностики все более востребованным:

Срок проведения. Несмотря на сложность проведения анализа, он готовится намного быстрее других лабораторных методов диагностики туберкулеза (около пяти часов). Это свойство анализа ПЦР становится особенно важным, когда анализ необходимо провести экстренно.
Анализ ПЦР абсолютно безопасен и может проводиться беременным женщинам и детям.
ПЦР-исследование можно сделать, когда по каким-то причинам нельзя выполнить другие методы диагностики.
С помощью ПЦР-диагностики можно провести исследование любой биологической жидкости на выбор. В некоторых случаях это имеет большое значение.
Позволяет обнаружить возбудителя на любой фазе заболевания. Даже после проведенного лечения, сохранившиеся остатки ДНК мертвых микобактерий будут обнаружены.
Высочайшая чувствительность этого метода позволяет обнаруживать в биологическом материале даже единичные фрагменты ДНК микроорганизмов.
Метод ПЦР позволяет не только обнаружить присутствие заболевания, но и может определить генотип возбудителя, отличив его от похожих микроорганизмов.
ПЦР-исследование очень эффективно при рецидивирующем течении заболевания.
Благодаря высочайшей чувствительности, анализ ПЦР может распознать микобактерии в организме человека, когда он только недавно инфицировался туберкулезом, задолго до появления клинических симптомов.

Казалось бы, метод ПЦР-диагностики содержит в себе только плюсы, но это не так.

Минусы этого метода исследования тоже существенны. При выборе метода исследования туберкулеза это также стоит учитывать:

Это дорогостоящий метод исследования. Для проведения ПЦР-диагностики нужна специально-оборудованная лаборатория. Оборудование для таких исследований стоит очень дорого, и не во всякой лаборатории оно имеется. В крайнем случае, можно обратиться в платную лабораторию.
Сразу же после проведенного лечения метод ПЦР применять не рекомендуется. В крови пациента некоторое время сохраняется небольшое количество живых и мертвых микобактерий. Если провести анализ в этот период, он покажет ложноположительный результат.
При мутациях микобактерий, анализ будет недостоверным, так как нормальная ДНК не сможет синтезироваться.
Для ПЦР-исследования имеет значение правильный выбор биологической жидкости на анализ.
Сверхчувствительность. Это тот случай, когда достоинство метода становится его недостатком. Если при проведении анализа в биологический материал каким-то образом попадет даже единичный фрагмент чужеродного ДНК, то ПЦР его размножит, и будет получен ложный результат.

ПЦР-лаборатория имеется только в крупных противотуберкулезных диспансерах и диагностических центрах.

Объясняется это высокой стоимостью оборудования и высокими требованиями к содержанию лаборатории (реактивы, обработка).

Медицинские чиновники не сильно переживают из-за отсутствия ПЦР-лаборатории в каком-то конкретном населенном пункте, поскольку анализы на туберкулёз можно провести другими методами (культивирование микобактерий, микроскопическое исследование).

Если в населённом пункте нет бесплатной ПЦР-лаборатории, пациент по желанию может обратиться в платное учреждение.

В последнее время ПЦР-диагностика занимает все более прочные позиции в диагностике туберкулеза и других заболеваний, отодвигая на задний план другие методы диагностики.

источник

Расшифровка результатов анализа ПЦР на туберкулез.

Всем школьникам ежегодно делают реакцию Манту, при помощи которой выявляют заболевание туберкулёзом.

В наше время набирает обороты диагностика заболевания туберкулёзом посредством анализа ПЦР.

Сейчас этот метод считается самым точным и эффективным способом диагностики.

С каждым годом частота заболеваний этой тяжелой инфекцией становится всё больше.

Медики стараются найти более надёжные способы выявления инфицирования микобактериями на самых ранних стадиях их развития.

Болезнь, обнаруженная в самом начале развития, лечится намного легче, чем, когда она перешла в более активную фазу. Именно с этой целью сейчас и применяют анализ ПЦР.

ПЦР – полимеразно-цепная реакция. Прибегнув к её помощи можно всего лишь в течение нескольких часов выявить наличие палочки Коха, даже если она будет всего одна среди огромного количества других клеток.

самое главное – стопроцентное обнаружение микобактерий, потому что в пробе, взятой на анализ определяется от 10 до 100 клеток;
анализ очень быстрый – на его проведение нужно всего 4-4,5 часа;
специфичность ДНК микобактерий очень высокая;
выявление туберкулёза лёгких практически на начальной стадии, для других методов это можно сказать просто нереально;
определяется только часть бактерии возбудителя заболевания, которая характерна только для этого вида микобактерий;
для исследования подходят: кровь, кал, слюна, моча, мокрота, спинномозговая жидкость;
для проведения такого метода исследований нет противопоказаний, его можно применять для обследования детей и беременных.

Для исследования на заболевание туберкулёзом чаще всего берут мокроту, которая выделяется во время кашля.

Взятую пробу помещают в специальный прибор — амплификатор, который удваивает цепочки ДНК.

Затем их исследуют на наличие ДНК микобактерий туберкулёзис, способствующих развитию туберкулёза.

На основании этих испытаний делают заключение: результат может быть положительным или отрицательным.

Современное медицинское оборудование способно провести не только полимеразно-цепную реакцию, а ещё и выдать результаты проведённого обследования, их расшифрует врач-фтизиатр.

Иногда результаты этого анализа бывают ложноположительными. Это может произойти только в случаях неправильной подготовки к забору, сдаче или транспортировке материалов для проведения анализа.

Именно по этой причине больным и докторам необходимо строго выполнять правила.

Результат расшифровки анализов бывает простым или сложным. Простой – определяется формулировкой «положительно» или «отрицательно».

Наличие отрицательного значения расшифровки говорит, что в образце, представленном для исследования, не выявлено следов ДНК микобактерий туберкулёза и пациент здоров.

В случаях, когда расшифровка имеет положительное значение производится сложная расшифровка этого теста.

Этот вид расшифровки помогает сделать наиболее точные выводы.

Пациенты не могут самостоятельно и правильно расшифровать полученные данные. Это сделает врач и всё подробно объяснит больному.

Благодаря этим показателям доктор определит местоположение очагов, стадии их развития и причины появления туберкулёзной инфекции.

На основании этих выводов выбираются методы и препараты для необходимого лечения.

о результате говорит содержание относительных единиц. В случае, когда их менее 0,9 – результат отрицательный;
когда содержание относительных единиц 0,9 — 1,1 – результат сомнительный;
в случаях, когда присутствие относительных единиц превышает 1,1 — результат является положительным.

Сделать анализ ПЦР часто направляют больных, в случаях затруднительной постановки диагноза. Обычно это тест проводят комплексно вместе с другими исследованиями.

Это делается в случаях подозрения первичного инфицирования, а другие способы не позволяют выявить заболевание.

Или же ПЦР-диагностику проводят в случаях, если больной самостоятельно не может прибыть в лабораторию, тогда материалы для проведения анализа доставляют его родственники.

Это может быть моча, мокрота, слюна или посев. Посевы на дому могут сделать только медицинские работники, имеющие сертификат на выполнение таких действий.

Именно ПЦР поможет выявить заболевания туберкулёзом у детей. Это исследование совершенно безвредно и имеет более высокую точность, в сравнении с пробой Манту.

Также проведение этого анализа показано и беременным женщинам, которым нельзя делать флюорографию.

Используют ПЦР-анализ и пред проведением операций, потому что такой способ более быстрый и точный.

Если возникли сомнения в результатах рентгена лёгких и пробы Манту, такую диагностику можно пройти самостоятельно.

При заболевании туберкулёзом проводится масса различных анализов, которые назначает врач, чтобы как можно точнее поставить диагноз. Часто приходится проходить целый комплекс анализов.

Иногда в расшифровке ИФА могут быть ложноположительные результаты, из-за содержания в крови антител после приёма курса лечения.

Также недостоверными могут оказаться и другие исследования. На данный момент ПЦР — самый точный из способов диагностики.

Направить на ПЦР-диагностику сможет любой из перечисленных специалистов, а расшифрует результаты и сделает окончательные выводы — врач-фтизиатр.

Кроме этого фтизиатр изберёт нужный курс лечения и где именно его потребуется пройти: в условиях специализированного стационара или же на дому.

Вместе с этим даст пациенту нужные рекомендации по борьбе с этим заболеванием.

Хоть этот способ и универсален и высокоточен, но его использование повсеместно просто невозможно.

Потому что для его проведения нужно очень дорогое оборудование, и не во всех государственных поликлиниках и больницах есть средства, для его приобретения.

А сдать такой анализ в платных клиниках есть возможность далеко не у всех пациентов.

этот анализ имеет высокую стоимость;
быстрые мутации и изменения микобактерий сводят эффективность ПЦР-анализа к нулю, потому что происходит изменение строения цепочек ДНК бактерий;
необходимо правильно выбрать материал, который будет подвержен исследованию, в противном случае оно не будет эффективно. Если при туберкулёзе лёгких взять на исследование мочу, то ПЦР-тест не выявит присутствия микобактерий.

Исследования ПЦР – новые методики, которые уже очень хорошо зарекомендовали себя. Самым большим плюсом этих исследований стала универсальность.

Для проведения этого анализа можно использовать любую среду: спинномозговую жидкость, кровь, слюну, мочу, мокроту и т.д.

При современной оснащённости лабораторий выявить микобактерии можно разными способами на ранних стадиях развития и у взрослых, и у детей.

Но несмотря на все профилактические меры и рекомендации, которые проводятся нашими медиками, заболеваемость растёт год от года.

Расшифровывая результаты исследований, врачи делают заключение, что каждый раз патология приобретает всё более тяжелые и осложнённые формы.

За всё происходящее вина лежит, в первую очередь на самих больных. Сделайте регулярными профилактические посещения врача.

Сегодняшние методы диагностики различных заболеваний в значительной степени облегчают лечение и снижают риск осложнений.

источник

Туберкулез — хроническое инфекционное заболевание, вызываемое микобактерией туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). Микобактерия была открыта в 1882 году немецким бактериологом Р. Кохом, поэтому ее часто называют палочкой Коха.

Микобактерии туберкулеза широко распространены в окружающей среде. Носителями и источником инфекции являются больные люди и крупный рогатый скот. Заражение чаще происходит через дыхательные пути и реже — алиментарным путем.

После проникновения в организм человека микобактерии инфицируют макрофагов, образуя в дальнейшем микобактериальные фагосомы. Микобактерии противодействуют дальнейшему превращению фагосомы, нарушая процессы лизиса бактериальной клетки. Такой механизм защиты позволяет микобактериям выживать в клетках хозяина. Находясь в макрофаге, микобактерии размножаются. После гибели макрофага, бактерии попадают во внеклеточную среду. Дальнейшее существование бактерий зависит от иммунных свойств организма — активности макрофагов и Т-лимфоцитов.

К роду микобактерий относится несколько десятков видов. Основную угрозу для здоровья людей несут микобактерии человека (Mycobacterium tuberculosis) и микобактерии бычьего типа (Mycobacterium bovis). Кроме них, патогенными свойствами обладают микобактерии Mycobacterium africanum, М. microti, М. canetti, М. caprae, М. pinnipedii. Эти виды проводят к развитию туберкулеза человека с его типичными клиническими и морфологическими признаками. Перечисленные микобактерии составляют, так называемый, комплекс туберкулезных микобактерий (МТВС). Выделяют также Мycobacterium avium complex (M.avium, М. avium paratuberculosis и др.). В него входят бактерии, вызывающие диссеминированные процессы внелегочной локализации у человека.

К нетуберкулезным видам микобактерий, приводящих к развитию микобактериозов, относятся такие виды, как Mycobacterium chelonae, M. kansassi, M. xenopi и другие. Эти микобактерии вызывают заболевания легких, похожие на туберкулезный процесс, однако они более эффективно поддаются лечению противотуберкулезными средствами.

Один из видов микобактерий вызывает другое серьезное заболевание — лепру. Возбудителем в этом случае является Mycobacterium leprae.

Микобактерии чрезвычайно устойчивы во внешней среде. В высохшей мокроте и в пыли они могут находиться до 1 года, в почве до полугода. Их высокая устойчивость создает значительные трудности в борьбе с этой инфекцией.

Важной особенностью микобактерий является их свойство долгое время находиться в организме человека в латентном состоянии. При определенных ситуациях латентная фаза, протекающая без клинических проявлений, может перейти в активную форму. Скрытое протекание инфекции и стертость клинических проявлений существенно затрудняют раннюю выявляемость заболевания. Именно поэтому диагностика латентного туберкулеза является крайне важной.

Разработано большое количество лабораторных тестов для идентификации микобактерий туберкулеза в различных биологических жидкостях и тканях. Основными являются микроскопия биологических жидкостей с окраской мазков по Цилю-Нильсену, бактериологический посев, серологические методы исследования, применение метода полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Микроскопический способ выявления микобактерий основан на их способности окрашиваться в красный цвет при использовании специальных красителей, тогда как другая микрофлора приобретает при этом синий цвет. Недостатком метода является его низкая чувствительность, поскольку для выявления микобактерий требуется их достаточное содержание в исследуемом образце. Повышение чувствительности микроскопического метода можно увеличить, применяя люминисцентную микроскопию.

Высокочувствительными методами диагностики туберкулеза являются серологические методы диагностики. После встречи человека с бациллой туберкулеза, как и с любым другим чужеродными агентом (вирусы, бактерии, глистная инвазия), иммунная система человека начинает вырабатывать специфические белки — антитела, блокирующие жизнедеятельность бактерий. Так осуществляется один из видов защиты организма человека от многочисленных болезнетворных микробов и вирусов.

После внедрения бактерий туберкулеза клетки иммунной системы начинают вырабатывать специфические антитела различных классов — IgM, IgA, IgG, которые циркулируют в кровеносном русле. На обнаружении таких специфических антител построена серологическая диагностика туберкулеза.

К основным современным методам серологической диагностики относятся тест-системы, основанные на технологиях, использующихся в иммунохимии — ИФА (иммуноферментное исследование), РИА (радиоиммунный анализ), иммунохроматографические методы (Hexagon TB, TB Check-1), иммуноблот. Повышение чувствительности методов ИФА постепенно приводят к вытеснению дорогостоящих радиоиммунных методов в диагностике туберкулеза.

Первыми антителами, появляющимися в крови, являются антитела класса IgM. Как правило, они выявляются в сыворотке крови через 2-3 недели после встречи с инфекцией и могут обнаруживаться на протяжении двух лет. Большинство тестов на основе ИФА технологий разработано для выявления антител класса IgG и суммарных антител (IgG + IgA + IgM).

Метод иммуноблота относится к подтверждающим методам диагностики наличия инфекционного процесса, поскольку позволяет выявлять одновременно несколько видов антител различных классов иммуноглобулинов к различным белкам бактерий. Разновидностью иммуноблота можно считать метод TB-Spot, где в качестве антигенов используются два вещества, довольно специфичных именно для микобактерий (липоарабиноманнан и белок весом 38 кДа). При наличии антител к микобактериям туберкулеза в сыворотке крови происходит их связывание с данными белками, сопровождающееся характерной окраской.

Микобактерия туберкулеза имеет в своем составе различные вещества (антигены), на которые организм человека вырабатывает антитела. Чем специфичнее/уникальнее бактериальный антиген, тем специфичнее будут образоваться на этот антиген антитела. Проблема повышения специфичности состоит в обнаружении таких антигенов и создании высокоспецифичных ИФА тест-систем для диагностики туберкулеза. Одним из таких белков, применяющихся в одностадийной тест-системе, является белок А60, специфичный для микобактерии. Этот белок после специальной очистки фиксируется на мембране. После добавления сыворотки больного человека и наличия в ней антител происходит их связывание с белком. Место связывание окрашивается в красно-фиолетовый цвет.

Применение иммуноферментных методов исследования является важным приемом в диагностике латентного туберкулеза. Выявление антител при помощи иммуноферментных технологий возможно не только в сыворотке крови, но и в моче, плевральной жидкости, мокроте, спинномозговой жидкости.

Бактериологический метод (посев материала на специальные среды) обнаружения микобактерий туберкулеза является высокоспецифичным методом, но имеет существенный недостаток: для идентификации бактерии при посеве на классические среды требуется около 4-8 недель. Этот способ выделения микобактерий обладает большей чувствительностью по сравнению с микроскопическим методом и позволяет после обнаружения микобактерий провести исследование по определению чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Применение новых питательных сред и специализированного бактериологического оборудования позволяет определить рост микобактерий уже через 2 недели.

После расшифровки ДНК микобактерий туберкулеза и введения в лабораторную практику метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), данный способ стал широко применяться в диагностике этого заболевания. Метод высокоспецифичен и позволяет проводить исследования небольшого количества материала. По оценкам ряда исследователей, метод ПЦР по чувствительности и специфичности превосходит культуральный метод диагностики при внелегочных формах туберкулеза.

Цитологические и гистологические методы диагностики туберкулеза позволяют выявить характерные морфологические признаки наличия заболевания. Обнаружение клеток Лангханса может свидетельствовать о наличии туберкулеза. Следует учитывать, что эти клетки могут появляться и при других инфекционных заболеваниях — саркоидозе, сифилисе, бруцеллезе.

Одним из самых ранних методов диагностики туберкулеза является реакция Манту (с 1908 года). Суть этой реакции заключается во введении внутрикожно туберкулина, представляющего собой очищенную смесь убитых культур микобактерий человека и бычьего вида. Результат пробы оценивают по величине инфильтрата через трое суток.

Современное развитие иммунологии и иммунохимии привело к внедрению новых тестов в диагностике туберкулеза — «диаскинтест» и «квантифероновый тест».

Проведение диаскинтеста заключается во внутрикожном введении двух белков, присутствующих у микобактерий опасных для человека, с последующей оценкой реакции в месте введения.

Квантифероновый тест проводится в пробирке крови взятой у пациента. Тест основан на способности белков, выделенных из микобактерий туберкулеза, стимулировать выработку гамма-интерферона сенсибилизированными Т-лимфоцитами человека, то есть инфицированного пациента.

Накопленный опыт в лечении туберкулеза свидетельствует о трудностях диагностики этого заболевания. Применение одного метода часто бывает недостаточно, поэтому существует необходимость использования различных приемов из арсенала инструментальных и лабораторных способов. Следует учитывать, что каждый из методов имеет свои недостатки, а их сочетание может привести к более достоверному заключению.

источник

Инновационный метод выявления микроорганизмов, в конце прошлого столетия изобретенный ученым Кэри Муллисом – анализ ПЦР. Он получил за свои труды Нобелевскую премию. Полностью этот процесс имеет название полимеразой цепной реакции. Он заключается в восстановлении типа микроорганизма в предоставленном биоматериале по коротким фрагментам ДНК. Это позволяет выявить инфицирование на ранней стадии и сразу начать лечение, не доводя до появления серьезных симптомов и осложнений.

Диагностика методом ПЦР заключается в получении сегментов патогенной ДНК из биологического материала и выстраивание их в правильную цепочку. Это позволяет идентифицировать микроорганизм, которому принадлежат клетки.

Процедура проводится в три этапа:

Сбор биологического материала.
Выявление и выстраивание ДНК.
Распознавание инфекции.

Для этого исследования требуется специальное медицинское оборудование – амплификатор. Он оснащен камерой, где исследуемый материал взаимодействует с высокой температурой и химическими ферментами. На выходе лаборант имеет длинную цепочку ДНК возбудителя болезни, если таковой имеется в организме человека.

Анализ ПЦР – это сложный генно-инженерный процесс, требующий аккуратности и серьезного отношения, как от лаборантов, так и от пациентов. Большую роль в корректности результатов анализа играет подготовка к процедуре, то есть правильный сбор материала.

Основными источниками для получения информации о болезни являются:

Могут использоваться и другие варианты, жидкости при необходимости берутся на анализ из разных органов.

Для пациента предусмотрены определенные правила, которые нужно выполнять перед процедурой. Если предстоит анализ крови, то запрещается за 8 часов до сбора:

употреблять пищу;
курить;
пить алкогольные напитки;
принимать внутрь лекарственные средства.

Вечером перед сбором мокроты выпивается препарат для ее разжижения и облегчения отхаркивания. Утром собрать материал после тщательных гигиенических процедур полости рта.

Моча собирается в стерильную баночку утром натощак, после подмывания, до приема каких-либо медикаментов.

Если человек принимает антибиотики, то проведение анализа полимеразной цепной реакции следует отложить, иначе результат ПЦР не является достоверным. Сдавать мокроту или кровь следует спустя две недели после окончания курса лечения.

Если описать кратко, то процесс заключается в выделении части ДНК. Применение современных методов генной инженерии позволяет определить вид микроорганизма. Причем материала для анализа нужно небольшое количество.

Технически это очень сложная процедура, но она занимает меньше времени, чем классические бактериологические исследования. Возбудителей не нужно выделять из биоматериала, нет нужды растить их в течение нескольких недель. В день сдачи пациент уже может узнать результат своего анализа.

Весь процесс ПЦР протекает поэтапно:

Ведется работа с первичной формой ДНК, которая при высокой температуре, близкой к 100 градусам, делится на две цепочки.
Температура понижается, нити соединяются с фрагментами нуклеиновой кислоты – праймером.
Происходит элонгация – синтез молекулярной структуры.

Весь сеанс состоит примерно из тридцати таких процедур, повторяющихся циклом как цепная реакция. Это необходимо для создания того количества клеток, при котором полученные бактерии станут распознаваемы.

Описание результата ПЦР (полимеразной цепной реакции) дает фтизиатр, она бывает простой или развернутой. В первом случае описание будет содержать только информацию о наличии или отсутствии палочки Коха. Если расшифровка подробная, из нее можно узнать степень распространения болезни, ее очаг. По этим критериям можно определить наиболее подходящее лечение туберкулеза в каждом случае.

Анализ полимеразой цепной реакции не различает живых и мертвых возбудителей, а говорит только об их наличии. Поэтому имеет смысл сдавать повторный тест на туберкулез только через 3-4 недели после прохождения назначенной врачом терапии.

Если результат положительный, на заключении ставится надпись «Mycobacterium tuberculosis». При отрицательном результате, рядом с биологическим названием бактерии есть пометка «не обнаружены». Анализы могут оказаться ложноположительными. Такое происходит редко – при нарушении техники выполнения исследований ПЦР или при наличии нежизнеспособных микроорганизмов. Окончательный вывод о заболевании может сделать только врач-фтизиатр.

ПЦР-диагностика туберкулеза завоевала популярность по многим причинам. Она имеет массу достоинств, среди которых:

Точность исследования. При проведении анализа с соблюдением технологии удается выявить бактерии, даже если они присутствуют в малом количестве.
Быстрый результат. Весь процесс от сбора материала до готового заключения занимает около 5 часов. Если сравнить с посевом, его приходится ждать до нескольких недель.
Полная безопасность для человека, в отличие от флюорографии с ее облучением.
Используется любой жидкий биоматериал. Для осуществления ПЦР при туберкулезе легких наиболее точную информацию дает мокрота, при туберкулезном менингите берется образец из спинного мозга. Анализ крови помогает выявить местные очаги инфекции.
Проверяется чувствительность бактерий к антибиотикам. Это позволяет назначить правильное лечение.
Ранняя диагностика. Узнать о наличии заболевания можно до появления ее симптомов.

Кроме положительных моментов есть и недостатки. Главный из них – это цена. Анализ ПЦР не из дешевых, что связано с использованием дорогого оборудования. Еще один минус – необходимость выжидать время для проведения повторного теста после курса лечения от туберкулеза. Иногда результат проверки получается ложноположительным. Такое бывает из-за мутации бактерий.

ПЦР на туберкулез легких не имеет противопоказаний и абсолютно безопасен. Поэтому есть определенные ситуации и заболевания, когда это единственная возможность исследования.

беременность;
контакт с туберкулезным больным;
трудности в определении диагноза при заболевании легких;
обследование перед операцией;
аллергическая реакция;
ВИЧ-инфекция;
малолетний возраст.

Воспользоваться методом ПЦР можно по направлению, которое выдается в фтизиатрии, а также педиатром, терапевтом или пульмонологом.

Другие виды обследования не изжили себя, а продолжают использоваться. Их применяют в тех случаях, когда нет возможности выполнить ПЦР на туберкулез. К тому же современный метод неидеален, иногда его показатели подвергаются сомнению и требуют перепроверки.

Определить наличие туберкулеза у человека помогают следующие способы:

туберкулинодиагностика (Манту);
флюорография;
тестирование биологического материала на флору;
рентген легких.

Эти исследования являются бесплатными и доступными для каждого. Но у них есть свои недостатки:

Тест на туберкулез вызывает аллергию. Противопоказан при заболеваниях кожи.
Рентгенологические исследования сопровождаются облучением, что неприменимо к детям, людям с иммунодефицитом и беременным женщинам.
Бактериологические анализы занимают гораздо большее количество времени, результата можно ждать до месяца.

Альтернативные варианты не являются гарантией стопроцентно правильного заключения. Они чаще всего используются в профилактических целях. Диагностирование туберкулеза методом ПЦР дает наиболее достоверную информацию. Если есть возможность, то лучше воспользоваться именно им.

Ребенка следует особенно оберегать от заболевания – туберкулезная инфекция может нанести серьезный вред организму с еще не совсем сформировавшимся иммунитетом.

После попадания палочки Коха в детский организм развитие заболевания проходит такие стадии:

Латентная. Продолжается до года, не выдавая себя никакими симптомами.
Интоксикация. Сказывается на общем состоянии здоровья. Появляется слабость, апатия, отсутствие аппетита, сонливость и снижение работоспособности. Постоянно немного повышена температура.
Первичная форма заболевания. Туберкулез локализуется, образуя очаг заболевания. У ребенка возникает кашель, одышка, головная боль, увеличение лимфоузлов.
Туберкулезный бронхоаденит. Симптомами являются боль в лопатках, кашель с разной тональностью звука, хрипы.

Обычно для выявления инфекции под кожу ребенка вводится туберкулин. Если к этому виду обследования имеются противопоказания, то ПЦР на туберкулез – незаменимый вариант для диагностики. Дети обычно сдают анализ крови, но при необходимости собирается и мокрота. При малейшем подозрении на наличие туберкулез проводятся дополнительные исследования, чтобы убедиться в положительном результате и сразу начать лечение на ранней стадии, не допуская развития болезни.

Современные методы исследования всегда быстрее и надежнее. Жаль, что из-за дорого оборудования сделать такие анализы есть возможность не во всех медицинских учреждениях и населенных пунктах. Каким способом провести обследование обычно выбирает врач, но и у пациента есть право выбора. Если вам приходилось сдавать анализ ПЦР, расскажите об этом в комментариях. Если статья оказалась для вас полезной, поделитесь ей в соцсетях – возможно, она поможет вашим друзьям.

источник